基于三孢布拉霉诱变高产番茄红素突变株的色素合成调控机制研究

来源 :河南师范大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:sun54965436
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番茄红素作为一类具有重要功能的脂溶性色素,广泛分布于自然界中,具有抗癌、抗心脑血管疾病、抗氧化等功效,已被广泛应用到饲料、食品、保健品及化妆品等行业。随着人口的不断增长,番茄红素的需求量日益增加,从植物中提取已经不能满足人类的需要。因此,开发高产番茄红素微生物资源在食品保健以及医药生产等方面将具有十分重要的现实意义。三孢布拉霉(Blakeslea trispora)是唯一的工业化生产番茄红素的菌株。许多研究者为了提高番茄红素产量,做了很多工作,但是,到目前为止,番茄红素的产量和质量仍远远不能满足人们的需求,主要的原因是对于番茄红素合成过程的调控机制不明确,难以通过基因工程手段改造菌株实现高产。因此,通过分子手段研究该菌株合成色素的调控机制势在必行,可以为该菌株的遗传改造和发酵条件调控提供重要理论支撑。本研究通过ARTP诱变育种、建立高通量筛选方法,获得高产菌株,并通过转录组分析研究了高产菌株合成番茄红素的分子机理,进而通过氧化胁迫进一步提高菌株的色素产量,为菌株的进一步遗传改造提供重要基础。获得如下创新性结果:(1)以负菌Blakeslea trispora(-)为出发菌株,经ARTP诱变,并构建了24孔板高通量筛选策略,最终从500株诱变存活菌株中快速筛选得到高产番茄红素突变菌株WY239,经120 h摇瓶发酵培养后,番茄红素产量为892.46 mg/L,比出发菌株产量提高了45%。通过五代传代培养发酵,结果显示高产番茄红素突变菌株WY239具有良好的遗传稳定性。(2)对出发菌株和突变菌株进行转录组分析,差异表达的基因一共有2257个,表达量显著上调的基因有1445个,表达量显著下调的基因有812个。表达量发生显著变化的基因大多与糖酵解、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、类胡萝卜素合成、甾醇的生物合成等代谢通路相关。糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸合成受到了明显的下调,而有利于番茄红素前体物质乙酰-CoA增加的代谢途径出现了明显上调,如脂肪酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等降解途径。在类胡萝卜素合成途径中,番茄红素合成的主代谢途径得到明显加强,代谢支路相关基因出现了明显下调,如甾醇、角鲨烯等合成途径。(3)研究了氧化胁迫对番茄红素产量的影响。对原始菌株和诱变获得的高产菌株WY239分别进行过氧化氢氧化胁迫研究,结果表明,在原始菌株发酵第60 h,在25 mL发酵液里添加4μL 30%H2O2时产量达到最高值(980.03±0.03)mg/L,比对照提高了63.3%。添加过氧化氢的三孢布拉霉在发酵过程中比对照的CAT和SOD的比酶活都有不同程度的提高;对WY239进行添加过氧化氢发酵处理,最高产量达到1120.69 mg/L,是添加前的25.56%,是出发菌株的83.91%。(4)真菌色素是重要的天然食品着色剂,本研究从染菌的平板中分离得到了一株产水溶性红色素的真菌。该真菌的核糖体RNA基因的IT1-IT4序列与产紫踝节菌(Talaromyces purpurogenum)具有99%相似性,并在Neighbor-Joining构建的系统发育树上聚为一簇。菌株在发酵120 h时红色素产量最高,并且该色素为胞外次级代谢产物。光谱学和高效液相色谱分析表明,该色素在495 nm处具有最大吸收峰,由四种以上单色素组分组成,与目前常见的番茄红素、红曲红胺都不同;该色素对温度、光照和pH具有较强的稳定性,但易被氧化剂和还原剂降解。该色素是胞外水溶性色素,相比三孢不拉霉菌的胞内脂溶性色素,在色素提取方面具有明显的优势,具有较大开发价值。
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