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背景：单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)通过破损的皮肤或粘膜侵入人体,引起角膜疱疹、病毒性脑炎、生殖道疱疹等多种感染,严重感染可致失明或死亡,并可在机体内终身潜伏,伴随无症状或有症状的周期性复发,其人群感染率高达60%~95%,造成较严重的疾病负担。目前常用的化学核苷类似物不能有效抑制HSV病毒的感染,探求有效抗HSV感染的治疗方法具有重要意义。研究发现携带干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)的HSV扩增子载体经颅内局部注射给药后表现了较好的靶向抗HSV作用。传统研究采用了质粒型HSV扩增子载体,研究发现其骨架上的细菌元件可抑制外源基因的表达,而去除细菌元件后的小环状扩增子可以介导外源基因的长期稳定表达。整合酶ФC31介导的细菌内重组可产生小环状扩增子,但存在费时、入门质粒载体污染等问题。本实验前期研究发现双腺病毒载体可在体外培养的真核细胞内通过Cre-loxp重组产生小环状扩增子,并可被辅助病毒包装形成假病毒,该重组方法省时省力、提高了小环状扩增子的产率。目的:目的：本研究拟观察双腺病毒载体能否在体内粘膜上皮细胞中通过Cre-loxp重组产生小环状扩增子,以及其携带的IFN-γ的抗HSV-2疗效。方法:1.体外细胞内重组:借助于LR重组技术构建启动子与报告基因编码序列同向分别置于HSV病毒基因元件复制起始Ori S与包装信号Pac的两端的两种腺病毒Adv-loxp-DOPCp-loxp与Adv-loxp-LOPCp-loxp,两者分别携带一种报告基因(表达红色荧光的Ds Red基因与表达β-半乳糖苷酶的Lac Z基因),分别与表达Cre酶的Adv-Cre共感染2-2细胞,通过观察报告基因的表达及PCR的方法验证体外培养细胞内是否重组产生小环状扩增子。2.体内粘膜上皮细胞内重组:将上述构建的Adv-loxp-DOPCp-loxp与Adv-loxp-LOPCp-loxp,分别与Adv-Cre按相同MOI接种急性HSV感染生殖道模型小鼠的生殖道,感染后收集阴道灌洗液,通过PCR、病毒培养观察荧光或粘膜组织切片β-半乳糖苷酶原位染色等方式确定粘膜上皮内是否形成小环状扩增子假病毒。3.粘膜重组小环状扩增子的抗HSV-2效应:采用同样的方法构建Adv-loxp-IRDOPCp-loxp(IFN-γ与Ds Red双基因表达盒),与Adv-Cre按相同MOI接种体外培养细胞或急性HSV感染生殖道模型小鼠的生殖道。体外细胞培养通过观察红色荧光蛋白表达与ELISA方法检测m IFNγ的方法验证表达IFN-γ与Ds Red的小环状扩增子是否构建成功。体内粘膜重组形成的表达IFN-γ的小环状扩增子被包成假病毒,其发挥的抗HSV-2作用通过观察急性HSV-2感染期小鼠存活率的方法进行研究。结果:1.体外细胞内重组:双腺病毒Adv-Cre与Adv-loxp-DOPCp-loxp(或Adv-loxp-LOPCp-loxp)感染2-2细胞后出现广泛的红色荧光表达(或β-半乳糖苷酶原位染色可见细胞蓝染),PCR扩增可得相应的目的条带,证明细胞内重组产生小环状扩增子。复制缺陷性病毒HSV-1–del ICP27辅助上述小环状扩增子包装得到含小环状扩增子假病毒与辅助病毒的混合病毒。2.体内粘膜上皮细胞内重组:急性期HSV小鼠生殖道感染模型建立,通过观察存活期的感染症状和生殖道粘膜组织HE染色的方法可证实。上述模型构建成功后经生殖道给予Adv-Cre与Adv-loxp-DOPCp-loxp(或Adv-loxp-LOPCp-loxp),阴道灌洗液PCR扩增得到目的条带。病毒分离培养或组织β-半乳糖苷酶原位染色阳性可见小环状扩增子形成假病毒,并随着HSV病毒而复制。3.粘膜重组小环状扩增子的抗HSV-2作用:Adv-Cre与Adv-loxp-IRDOPCp-loxp共感染2-2细胞,复制缺陷病毒株HSV-1–del ICP27辅助包装形成小环状扩增子MC-OPIRD假病毒,出现CPE病变,伴红色荧光蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ的表达。体内结果显示重组小环状扩增子病毒介导的m IFN-γ体内粘膜表达量显著高于对照组(p<0.01),急性感染期小鼠存活分析显示实验组小鼠生存率高于对照组(p<0.01)。结论:双腺病毒可在粘膜上皮内通过Cre-loxp重组产生小环状扩增子,并依赖于粘膜内已感染的HSV包装形成假病毒。表达干扰素γ的小环状扩增子对急性期粘膜单纯疱疹病毒感染可以起到抑制作用。