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研究目的膝关节软骨受损情况十分多见,一旦损伤自身愈合十分困难,如何有效治疗有广泛的研究需求。本研究旨将目前已部分应用于非膝关节软骨修复临床研究的支架材料聚己内酯(PCL)进行3D打印成纳米支架,和髌下脂肪垫干细胞(ADSCs)在一种特殊的双轴组织再生系统(Tis Xell系统)进行培养,利用培养出的组织工程软骨对膝关节损伤动物模型进行再生医学治疗。经过对细胞培养、分化、富集、增生的时长、数量和纯度情况以及组织工程软骨植入动物模型后修复情况,探讨该组织工程方案的可行性,分析该支架材料和细胞培养系统培养效果的实验数据。研究方法本研究按照三个阶段进行设计。第一个实验阶段,我们采用酶消化方式处理新西兰兔髌骨下脂肪干细胞,并进行体外培养、传代。采用传统的流式细胞技术,对脂肪干细胞CD44、90、45、34、29五种标记进行检测。分别加入诱导分化培养液促使ADSCs向成脂、成骨、成软骨方向分化,分别用油红O染色测定成脂肪细胞情况,用茜素红染色来测定成骨细胞情况,用甲苯胺蓝染色测定成软骨细胞情况。第二部分使用Tis Xell再生系统对ADSCs和3D打印PCL支架进行富集培养。使用MTT方式来检测所培养的细胞扩增总数。采用苏木精-伊红染色(HE)检测ADSCs在3D打印PCL支架中的不同时间点的分布和富集情况。第三实验阶段我们采用随机的选取方式将24只新西兰大白兔按每组6只,分成4个组。分别是空白对照组;模型组;ADSCs治疗组;3-D支架ADSCs治疗组。手术后6周、12周,经过外观查看和和组织学染色措施观察并评价膝关节软骨修复状况,对比ADSCs治疗组和3-D支架ADSCs治疗组修复软骨缺损的效果。研究结果成功分离并培养了兔髌下ADSCs,CD44、CD90、CD29这些间充质干细胞的表型抗原呈阳性标记,阳性细胞占的比率均超过了95%。CD45、CD34这些内皮细胞表型抗原呈阴性表达,阳性细胞占的比率不足2%。说明实验分离和增殖的ADSCs纯度到达要求。油红O染色,茜素红染色,甲苯胺蓝染色检测发现ADSCs具有很好的成脂、成骨。成软骨的分化潜能。通过Tis Xell再生系统富集培养后发现,ADSCs在3D打印PCL支架内密集生长,12天时细胞总数达到了108级,已经达到了进行体内接种实验的要求。通过膝关节面钻孔手术造模软骨损伤,6周12周后,ADSCs对关节软骨破坏具备修复能力,而经过Tis Xell再生系统将ADSCs富集于3D打印PCL支架的治疗组则形成了更多的透明软骨,对膝关节功能预后恢复有更佳的疗效。研究结论髌下ADSCs具备更好的成软骨分化的潜能,可以有效的对膝关节软骨损伤动物模型实施修复。3D打印PCL纳米支架具备良好的机械功能和孔径,能更好的对ADSCs实施富集扩增,并更好的诱导ADSCs分化成为透明软骨组织。Ti Xell再生系统和改良的培养基可以将组织工程软骨培养时间由通常的3-4周,缩短到12天。合成的组织工程软骨在膝关节软骨损害动物模型中应用,获得了满意的修复效果,为后期临床应用研究提供了新的组织工程再生方案。