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随着生物技术的发展，多种肿瘤抗原及其细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）表位被鉴定，并成为肿瘤免疫学及肿瘤疫苗发展的基础。其中，肿瘤/睾丸抗原（cancer/testis antigen, CTA）家族成员因其在肿瘤组织表达的特异性和在体内激发细胞免疫应答和体液免疫应答的有效性，成为这一领域研究的热点。以往的研究表明：非小细胞肺癌内表达多种CTA，如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-12、NY-ESO-1等，其中以MAGE-3和NY-ESO-1为靶标的免疫治疗已进入临床实验验证阶段，取得了令人鼓舞的效果。然而，由于不同肺癌患者CTA的差异性表达和肿瘤细胞的异质性，针对多种抗原的多价疫苗被认为是提高肿瘤免疫治疗的策略之一。因此，寻找新的肺癌内表达的CTA具有重要的理论意义和实际的应用前景。泰素耐药相关基因（Taxol resistant associated antigen, TRAG-3）编码的TRAG-3肿瘤抗原是由Duan等在寻找泰素耐药基因时在泰素耐药的卵巢癌细胞株（SKOVTR）中发现的一个新基因。由于它在肿瘤组织及正常组织中的表达模式和其染色体定位的特点与以往被鉴定的CTA一致，因而将其归类为CTA。基于上述事实，我们推测：TRAG-3可望作为肺癌免疫治疗的靶标。TRAG-3能否作为肺癌免疫治疗靶标必须具备两个条件：其一，由于CTL对肿瘤细胞的免疫识别是通过识别肿瘤细胞表达的肿瘤抗原来实现的，因此非小细胞肺癌必须有TRAG-3表达是其作为肺癌免疫治疗靶标的前提条件；其二，特异性免疫治疗发挥疗效是通过活化CTL，从而由CTL对肿瘤细胞进行特异性杀伤，所以TRAG-3氨基酸序列内必须有CTL表位序列，并能够被肿瘤细胞MHCⅠ类分子递呈，才能实现CTL的活化和对肿瘤细胞的特异性杀伤。确定TRAG-3作为肺癌免疫治疗靶标的目的理所当然是要发展有效的免疫治疗策略。选择合适的肿瘤疫苗形式是保证免疫治疗疗效的关键因素。目前肿瘤疫苗有多种形式，其中负载表位肽的DC疫苗的Ⅰ、Ⅱ期临床实验已取得了令人鼓舞的结果，显示出了其在恶性肿瘤等疾病治疗中的巨大应用前景。基于上述认识，本课题从以下几个方面展开了研究：①分析非小细胞肺癌患者手术标本内TRAG-3抗原的表达情况及其临床意义；②确定DAC能否诱导TRAG-3表达阴性的肺腺癌A549细胞内TRAG-3表达；③鉴定TRAG-3来源HLA-A2.1限制性CTL表位；④以DC作为佐剂增强TRAG-3表位肽体外激发CTL的能力。<WP=11>通过以上研究，我们发现：1． TRAG-3抗原在非小细胞肺癌内的表达及其诱导表达（1）TRAG-3在非小细胞肺癌内的表达及其临床意义48例肺癌患者中，TRAG-3表达阳性率为54%，其中肺腺癌73%、肺鳞癌17%及大细胞肺癌33%，肺腺癌中的表达率与肺鳞癌相比有显著差异（P<0.05）；肿瘤患者术前化疗对TRAG-3的表达无影响，而肺癌患者的肿瘤分期与TRAG-3的表达也无明显的联系。以上结果提示：TRAG-3不能作为肺癌分期的诊断标志，但发展基于TRAG-3抗原的免疫治疗可望用于半数以上的非小细胞肺癌患者，尤其是肺腺癌患者。（2）DAC诱导肺腺癌A549细胞内TRAG-3的表达结果显示：未经任何处理的A549肺腺癌细胞内TRAG-3 mRNA和蛋白表达均为阴性；1.0 μmol的DAC处理24h后，即见A549细胞内mRNA和蛋白表达，直至7d仍可检测到TRAG-3表达。结合以往的报道，以上结果表明：DAC可望用于临床增强肺癌细胞的免疫原性，可在免疫治疗的前期应用，从而在免疫治疗阶段更有效的被CTL识别。2．TRAG-3来源HLA-A2.1限制性CTL表位的鉴定（1）TRAG-3来源HLA-A2.1限制性CTL表位的预测①根据超基序方案预测原则，发现P2、P9位氨基酸残基符合侯选表位标准的九肽共7个，分别是：GLIQLVEGV（4~12）、HACWPAFTV（37~45）、PAFTVLGEA（41~49）、SILLRDAGL（57~65）、ILLRDAGLV（58~66）、PLSNNHPPT（77~85）、QLGREKGPI（92~100）；②通过计算符合超基序方案的7个九肽的结合系数，符合HLA-A2.1限制性CTL表位条件的九肽共有4个，它们是：ILLRDAGLV（58~66）(100.04)、HACWPAFTV（37~45）(18.27)、GLIQLVEGV（4~12）（5.70）和SILLRDAGL（57~65）(8.60)。（2）预测表位肽的计算机辅助分子模拟TRAG-3来源的4个侯选CTL表位多肽均符合HLA-A2限制性CTL表位的标准；经分子动力学模拟发现，TRAG-3（37~45）多肽的羧基末端氨基酸（P9）侧链指向溶液，不符合HLA-A2.1限制性CTL表位的标准，而其余3个九肽的羧基末端氨基酸侧链均指向HLA-A2.1分子结合槽的凹槽F口袋中。（3）预测表位肽与HLA-A2.1分子的亲和力分析FCAS分析发现，经预测表位肽刺激后T2细胞的HLA-A2.1特异性平均荧光强度（mean florescence intensity, MFI）明显升高，其中经TRAG-3（58~66）处理后升高的最明显（97.53），其次为TRAG-3（4~12）（70.10）；而正常对照的T2细胞的MFI仅为34.65。经换算成荧光指数（florescence index, FI）后，九肽TRAG-3（58~66）的FI为1.80，符合<WP=12>与HLA-A2高结合力的条件；TRAG-3（4~12）的FI为1.02，符合中等结合力的条件；TRAG-3（57~65）和TRAG-3（37~45）则与HLA-A2.1分子呈低结合力。（4）TRAG-3 HLA-A2.1限制性CTL表位的实验鉴定4个侯选表位肽中，只有TRAG-3（