[研究背景与目的]大黄等蒽醌类中药及含蒽醌类成分的中药制剂在临床上使用广泛,使用频率较高。尤其在肥胖与顽固性便秘患者中,长期服用蒽醌类泻剂的情况十分普遍。但长期服用蒽醌类泻剂会导致结肠损伤以及结肠黑变病,甚至产生致癌风险。而蒽醌类化合物引起结肠黑变病,产生致癌风险的具体机制有待进一步研究。肠道菌群作为肠道直接接触的微环境,其与肿瘤、代谢性疾病等关系密切。因此,本实验选择代表性的蒽醌类化合物番泻苷A作为研究药物,从肠道菌群角度阐释蒽醌类泻剂导致结肠黑变病的机制,并为临床有效规避蒽醌类泻剂产生的不良反应提供参考。[研究内容与结果]本研究选择C57BL6小鼠作为研究对象,分为对照组与给药组。给药组每天灌胃给予100mg/kg番泻苷A 12周。通过统计分析小鼠体重,我们发现长期服用番泻苷A能显著抑制小鼠体重增长。同时通过对给药组与对照组小鼠结肠H&E染色,脂褐素染色以及黑色素染色分析后发现,番泻苷A诱导脂褐素与黑色素在结肠组织内的沉积。通过提取结肠组织mRNA,利用RT-PCR对结肠组织炎症因子IL-1β,IL-6,IL-10以及TNF-α的mRNA的表达进行检测,结果显示长期服用番泻苷A引起结肠组织产生轻度炎症;利用TUNEL法检测结肠组织细胞凋亡水平,结果表明长期服用番泻苷A后结肠组织凋亡水平升高;同时通过Ki67免疫荧光检测结肠组织增殖水平,结果表明长期服用番泻苷A会引起结肠隐窝部位增殖水平升高。以上结果表明长期服用番泻苷A能引起结肠组织细胞凋亡,并产生色素沉积,同时存在潜在致癌风险。考虑到番泻苷A体内引起结肠细胞凋亡的现象,利用体外细胞实验,进一步分析番泻苷A体外对正常人结肠上皮细胞的影响,结果显示番泻苷A在体外对正常结肠上皮细胞并没有显著的抑制作用。由于番泻苷A在体内的起效形式是大黄酸蒽酮,它是番泻苷A经肠道菌群产生的β-葡萄糖苷酶代谢后的产物,因此利用β-葡萄糖苷酶与番泻苷A共孵育作用于正常人结肠上皮细胞,MTT法检测后发现番泻苷A代谢产物对正常人结肠上皮细胞的增殖也没有显著的抑制作用。由此证明了番泻苷A对结肠的损伤作用需要体内其他的生物物质参与。考虑到肠道菌群是结肠组织直接接触的微环境,且番泻苷A药效作用的发挥依赖于肠道菌群,我们进一步检测番泻苷A对小鼠肠道菌群的影响。利用高通量测序技术对小鼠肠道菌群分析,结果显示番泻苷A对小鼠肠道菌群中的梭菌属具有显著抑制作用。而梭菌属菌主要合成结肠细胞生长所必须的短链脂肪酸,因此我们进一步检测了肠道短链脂肪酸的变化。利用GC/MS检测小鼠肠道短链脂肪酸的浓度后发现,番泻苷A对丁酸具有显著的抑制作用。通过灌肠给予给药组小鼠丁酸,再利用TUNEL法与Ki67免疫荧光检测小鼠结肠组织,结果表明外源性给予丁酸可显著抑制番泻苷A引起的上皮细胞凋亡与隐窝异常增殖。以上结果显示,番泻苷A通过抑制小鼠肠道产丁酸菌从而抑制肠道丁酸浓度引起结肠上皮细胞凋亡产生结肠黑变病。进一步通过粪便移植法验证肠道菌群在这一过程中的重要作用。给药同时进行粪便移植手术,取小鼠结肠组织,进行病理染色分析,炎性因子的RT-PCR检测后发现,粪便移植能有效抑制番泻苷A对结肠组织的损伤作用。进一步分析粪便移植后小鼠肠道菌群结构发现,粪便移植显著升高给药组小鼠肠道中产丁酸菌的相对丰度,同时能提高给药组小鼠肠道的丁酸浓度。[结论与意义]基于以上结果,我们发现番泻苷A通过抑制肠道产丁酸菌与肠道丁酸浓度引起结肠上皮细胞凋亡与结肠黑变病,同时引起结肠隐窝部位增殖水平升高产生潜在的致癌风险。通过灌肠给予丁酸或者进行粪便移植手术可以有效抑制番泻苷A对结肠组织的损伤。该课题从肠道菌群的角度阐明了长期服用番泻苷A引起结肠损伤,产生致结肠黑变病的风险机制,同时发现粪便移植可有效抑制番泻苷A的不良反应,从而为临床有效规避长期服用番泻苷A或者蒽醌类泻剂引起的不良反应提供参考。