基于核酸适配体的光学生物传感器检测OTA

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenhonghongshi
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赭曲霉毒素A(OTA)是一种毒性大、广泛存在于食物中(如:酒类、咖啡、谷物等)和饲料中的霉菌毒素,对人类的食品安全构成较大的威胁。因此,对其低成本、高灵敏度、简单、快速的检测是非常必要的。相较于传统的检测方法(仪器分析法、免疫分析法),核酸适配体具有可化学合成,稳定性好等优点,近年来使得核酸适配体生物传感器成为研究的热点。本论文基于荧光和化学发光构建了两种适配体传感器方法实现OTA的检测,并开发了一种核酸适配体优化方法。本论文包括三部分:第一部分基于鸟嘌呤碱基通过光诱导电子转移可猝灭荧光素(FAM),设计了一种以鸟嘌呤碱基作为猝灭剂,单荧光(FAM)标记寡核苷酸探针竞争法检测OTA的生物传感器。其中荧光标记寡核苷酸探针A、OTA与核酸适配体序列B的反应为竞争反应。在优化的实验条件下,测得在OTA浓度在0-8 nM之间,其线性方程为F=6.55×103+1.14×102cOTA(nM),R2=0.9996,获得的检出限(LOD)为2.0 nM。此方法简单,具有很好的普适性。第二部分基于第一部分的传感器的原理,构建了一种简单、快速优化核酸适配体序列的方法。核酸适配体作为OTA的生物识别元件,合理的优化核酸适配体的结构对未来的研究具有很重要的意义,基于前一部分工作,这里提出一套评价新型核酸适配体亲和性的方法,从而实现对原有核酸适配体的优化。最终确定3’端去除5个碱基的AP-OTA31为核心序列,并预测其结构是末端有三对互补碱基,且具有平末端,此结构适合构建新型生物传感器用以检测OTA。此方法操作简便、灵敏度高、用时短、具有普适性,可以应用于其他适配体序列的优化研究。第三部分根据筛选出的具有平末端的OTA核酸适配体,构建了一种基于分子内裂分G-四链体DNA酶化学发光法检测OTA的方法。将末端平齐的核酸适配体插在DNAzyme中间,使得核酸适配体识别靶标分子后的紧密程度成为影响DNAzyme形成的重要影响因素。本文就G四分体拆分时两端的碱基种类、腺嘌呤在G四链体末端的位置及腺嘌呤的数目,设计了 7条单链寡核甘酸序列,最终证明富G序列4-8拆分时DNAzyme活性更高,且5’端有两个A碱基时能提高DNAzyme的催化活性。加入甲酰胺后进一步提高了灵敏度和降低了检测限,检测限达到0.13 nM。这种设计为以平末端适配体为识别单元提供了一种以裂开型G-四链体DNAzyme为检测响应单元的高效方案。
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