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随着人口数量增长的加快和人口老龄化的加重,恶性肿瘤的发病率和死亡数量在全球范围内急剧增长,严重危害人类生命健康,并且造成巨大的社会经济负担。发现肿瘤诊断及干预治疗的新靶点具有重要意义。肿瘤患者体内免疫细胞尤其是T细胞处于耗竭状态,表现为免疫检查点分子表达升高、细胞因子分泌减少、对肿瘤细胞的杀伤能力降低。阻断免疫检查点分子可以有效逆转T细胞耗竭状态,清除肿瘤细胞。近几年基于免疫检查点阻断方式的肿瘤免疫疗法得到了越来越多的关注,其中,以CTLA-4和PD-1为靶点的免疫检查点阻断剂已经进入临床,并取得了良好的治疗效果,成为新一代肿瘤治疗手段。越来越多的研究发现,多种免疫抑制性受体通过RNA选择性拼接或脱落酶切割膜分子,产生可溶性分子,在免疫调节及相关疾病中发挥重要作用。免疫检查点分子LAG-3(Lymphocyte activation gene-3)的可溶性形式sLAG-3能够增强母本细胞的增殖能力。相较之下,可溶性CEACAM1(Soluble carcinoembryonic antigenelated cel1 adhesion molecule 1,sCEACAM1)以剂量依赖的方式阻断了CEACAM1对NK细胞的负性调节通路。上述研究提示,免疫抑制性受体的可溶性分子可能通过多种形式发挥作用,影响膜型免疫检查点分子功能。深入研究免疫抑制分子的可溶性形式及其生物学活性,对于完善基于免疫检查点的肿瘤免疫治疗具有重要意义。Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)是2002年发现的免疫抑制性受体,与CD8+T细胞耗竭密切相关,是目前研究最多的免疫治疗靶点之一。慢性病毒感染和肿瘤可以显著诱导T细胞表达Tim-3,并介导T细胞耗竭。此外,Tim-3参与调节固有免疫细胞和肿瘤干细胞,影响肿瘤的结局,在肿瘤发生发展中发挥重要功能。Tim-3分子的可溶性形式soluble Tim-3(sTim-3)首次发现于小鼠。研究证实,鼠Tim-3编码基因通过RNA选择性拼接生成800bp的mRNA,进而翻译形成sTim-3蛋白。荷瘤小鼠实验结果显示鼠sTim-3促进肿瘤生长,抑制T细胞增殖及IL-2、IFN-γ分泌。另有文献报道,鼠sTim-3分子胞外段(脱落酶切割产生的sTim-3)促进T细胞体外增殖和细胞因子分泌。近期文献报道人血清中同样存在sTim-3,但是人sTim-3的产生机制,尤其是在肿瘤免疫中的作用迄今尚未见报道。本论文收集健康人及多种消化系统肿瘤患者(肝癌、胃癌、结直肠癌和胆管癌)血清,ELISA检测sTim-3的水平,进而利用多种体内外实验研究人sTim-3的产生途径和sTim-3在肿瘤免疫中的作用。主要研究结果如下:一、消化系统肿瘤患者血清中sTim-3的水平显著升高为了检测肿瘤患者sTim-3的水平,本论文收集28例健康人和53例消化系统肿瘤患者(15例肝癌、16例胃癌、15例结直肠癌及7例胆管癌)及具有肝癌高危因素的43例慢乙肝患者的防凝血。离心后收集血清,ELISA检测sTim-3,结果发现:与健康人相比,肝癌患者、胃癌患者、结直肠癌患者和胆管癌患者血清中sTim-3的水平显著升高(p<0.0001)。慢乙肝患者血清中sTim-3的水平同样显著高于健康对照(p<0.000 1),相关性分析发现:慢乙肝患者sTim-3水平与ALT和AST正相关,提示sTim-3可能与HBV相关HCC进程相关。二、人sTim-3的来源研究1、人活化T细胞可以产生sTim-3膜型Tim-3分子主要由T细胞等多种免疫细胞表达。为了探究哪些细胞可以产生sTim-3,收集并分离健康人外周血免疫细胞,去除红细胞后以1x106个/ml的密度接种于24孔板,分别以不同浓度的LPS及anti-human CD3抗体联合anti-human CD28抗体刺激细胞,4天后收获细胞上清,ELISA检测sTim-3。结果显示:与未刺激组相比较,LPS刺激后免疫细胞产生的sTim-3没有显著升高,而经过anti-human CD3抗体和anti-human CD28抗体刺激的免疫细胞产生的sTim-3水平显著升高,且sTim-3的产生水平与CD3/CD28抗体浓度有一定的剂量依赖性。以上结果提示,人T细胞可以产生sTim-3。2、人sTim-3主要由ADAM10和ADAM17介导产生,并未检测到选择性拼接的人sTim-3 mRNA膜分子的可溶性形式主要有两种产生机制:RNA选择性拼接形成mRNA及膜分子蛋白被体内脱落酶切割。为了探究人sTim-3的产生机制,我们在人Tim-3基因的不同位置设计引物,分别扩增全长Tim-3及Tim-3分子mucin区和跨膜区(sTim-3不存在跨膜区)。收集20例健康人,19例慢乙肝患者和16例肝癌患者外周血免疫细胞,TRIZOL提取RNA,逆转录后得到cDNA。RT-PCR扩增结果显示:所有标本中均只扩增出约1000bp的全长Tim-3 mRNA分子,并未检测到选择性拼接的sTim-3 mRNA。进一步收集经过anti-human CD3和anti-human CD28刺激的外周血免疫细胞,同上RT-PCR扩增,得到了相同结果。上述结果提示,人sTim-3可能不存在RNA选择性拼接形式,这与文献报道一致。新近文献报道:脱落酶ADAM10和ADAM17是介导sTim-3产生的主要脱落酶。为探讨ADAM10/17在人sTim-3产生中的作用,分别以ADAM10抑制剂GI和ADAM17抑制剂TAPI-1处理经过anti-CD3和anti-CD28刺激的外周血免疫细胞,4天后收集上清,ELISA检测sTim-3的水平。结果显示:抑制剂GI和TAPI-1均能显著降低T细胞sTim-3的产生水平,即人sTim-3可以由ADAM10和ADAM17介导产生。进一步qPCR结果显示:慢乙肝患者和肝癌患者ADAM10表达显著高于健康人(p<0.05),而ADAM17的表达在这三种人群中没有显著性的差异,提示ADAM10介导sTim-3的产生可能在慢乙肝及肝癌的发生发展中发挥更加重要的作用。三、sTim-3在肿瘤免疫中的作用研究1、sTim-3不影响肿瘤细胞的增殖我们前期研究发现肿瘤微环境促进肝癌细胞表达膜Tim-3,进而促进肝癌细胞恶性增殖。为了探究sTim-3对肿瘤细胞的影响,利用体外合成的重组sTim-3蛋白处理肝癌细胞系HepG2、Huh7、Hepa1-6细胞和黑色素瘤细胞系B16F10。CCK8检测肿瘤细胞增殖,并绘制细胞生长曲线,结果显示:sTim-3蛋白刺激上述细胞后并不影响肿瘤细胞的增殖。为验证上述结果,构建sTim-3慢病毒质粒pUltra-IL2sig-hsTim-3,三质粒系统(辅助质粒:psPAx2和pMD2.G)包装慢病毒,收集病毒上清,感染B16F10-OVA细胞,流式分选后得到稳定表达sTim-3的B16F10-OVA细胞,空质粒pUltra包装慢病毒感染的B16F10-OVA细胞作为对照。CCK8检测结果显示:过表达sTim-3不影响B16F10-OVA细胞的增殖。进一步通过EDU掺入实验验证细胞增殖能力,流式细胞术检测获得了相同结果。为获得更好的对照,进一步构建sTim-3 AAV病毒质粒pscAAV-EGFP2A-IL2sig-hsTim-3,三质粒系统(辅助质粒:pHelper 和pAAV-DJ)包装AAV病毒,同上感染B16F10-OVA细胞,检测细胞增殖(pscAAV-GFP质粒包装AAV病毒为对照),结果显示:过表达sTim-3不影响B16F10-OVA细胞的增殖。2、sTim-3显著抑制T细胞分泌细胞因子Tim-3作为免疫抑制受体抑制T细胞功能,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。为了探究sTim-3对于免疫细胞的影响,选择人外周血免疫细胞及OT-Ⅰ小鼠脾细胞为研究模型,进行体外刺激,检测sTim-3蛋白处理后T细胞功能。(1)sTim-3显著抑制人外周T细胞分泌细胞因子:新鲜分离人外周血免疫细胞经sTim-3蛋白预处理后,anti-human CD3和anti-human CD28刺激,2天后收集上清,ELISA检测上清中细胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌。结果显示:与对照相比较,sTim-3蛋白处理显著抑制T细胞分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ。(2)sTim-3显著抑制OT-Ⅰ特异性T细胞分泌细胞因子:分离OT-Ⅰ小鼠脾细胞作为效应细胞,EL4细胞作为靶细胞,靶细胞分别与20pm、200pm、2nm OVA257-264抗原孵育1h后,再与效应细胞混合培养4-6h后收集细胞,流式细胞术检测T细胞细胞因子的分泌。结果显示:sTim-3蛋白处理显著抑制OT-Ⅰ特异性T细胞细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的分泌。以上结果表明:sTim-3蛋白显著抑制T细胞细胞因子的分泌。3、sTim-3显著促进肿瘤的生长,降低小鼠的生存期为了探究sTim-3的体内抗肿瘤活性,使用上述经过流式分选后稳定表达sTim-3的B16F10-OVA细胞进行小鼠皮下成瘤实验,每只小鼠皮下注射2x105个B16F10-OVA细胞(不表达sTim-3的B16F10-OVA细胞为对照),动态监测小鼠肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线以及小鼠的生存曲线。结果显示:sTim-3显著促进小鼠体内肿瘤的生长,并降低小鼠的生存期。由于sTim-3并不影响肿瘤细胞体外增殖能力,因此我们推测sTim-3通过影响肿瘤微环境促进小鼠体内肿瘤的生长。为了验证这一假说,分离上述小鼠肿瘤浸润淋巴细胞,流式检测结果显示:sTim-3过表达显著降低了小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞和CD4+T细胞的数量。进一步以PMA和离子霉素刺激新鲜分离的肿瘤浸润淋巴细胞,流式细胞术检测T细胞和NK细胞的细胞因子分泌。结果显示:与对照组相比较,sTim-3过表达显著抑制T细胞分泌TNF-α,并显著降低NK细胞产生TNF-α、IFN-γ和Granzyme B的能力。四、sTim-3发挥作用不依赖于膜型Tim-3分子为了探究sTim-3发挥作用是否依赖于膜型Tim-3分子,在Tim-3 KO小鼠中进行荷瘤实验。同上皮下接种过表达sTim-3的B16F10-OVA细胞,不表达sTim-3的B16F10-OVA细胞为对照。动态监测小鼠肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线以及小鼠的生存曲线。结果显示:sTim-3过表达促进了 Tim-3 KO小鼠体内黑色素瘤的生长,并明显降低了小鼠生存期,提示sTim-3发挥促肿瘤作用不依赖于膜型Tim-3分子。综上,本研究首次发现消化系统肿瘤患者sTim-3的水平显著升高,并证实人sTim-3主要由ADAM10和ADAM17介导产生。体内外功能研究发现,sTim-3显著抑制T细胞分泌细胞因子,影响肿瘤微环境促进荷瘤小鼠体内肿瘤细胞的生长。Tim-3 KO小鼠实验证实,sTim-3发挥作用并不依赖于膜型Tim-3分子。sTim-3如何发挥作用以及sTim-3与配体的作用方式有待进一步研究。总之,本研究首次发现sTim-3促进免疫抑制介导肿瘤免疫逃逸的作用,为揭示肿瘤发生机制提供了新思路,同时为免疫检查点治疗提供了新机制。