RNA干扰技术对食管癌细胞系Survivin基因表达的抑制作用及其促凋亡研究

来源 :汕头大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:Zero1_41004513
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第一部分食管癌组织中survivin蛋白的表达及其临床意义目的:Survivin基因与肿瘤的发生、生长和侵袭有关,但其在食管癌发病机理中的作用尚未明确。本研究通过免疫组织化学技术检测食管癌组织中survivin蛋白的表达,确定survivin基因在人食管癌组织中的表达水平,并探讨其临床意义。方法:以汕头大学医学院病理检验科05年9月至12月的38例食管癌患者手术切除标本为材料,其中男性31例,女性7例。年龄41-78岁,中位年龄58岁。采用免疫组织化学技术检测survivin蛋白的表达,对结果行统计学分析。结果:38例食管鳞癌中,survivin阳性24例,表达率为63.16%(24/38);远端正常对照组未见survivin阳性表达。Survivin阳性表达与年龄、肿瘤分化程度相关;但与性别和淋巴结转移无明显相关性。结论:Survivin蛋白在食管癌组织表达上调;Survivin基因可能成为食管癌基因治疗的靶点。第二部分RNA干扰表达载体抑EC-109细胞Survivin基因表达的体外研究目的:构建针对Survivin基因的RNA干扰表达载体,应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对Survivin基因的siRNA,抑制Survivin基因表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡。方法:EC-109细胞常规传代培养。利用分子克隆技术构建针对Survivin的siRNA表达质粒pSIREN/S,及对照质粒pSIREN/CN。将重组质粒转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率。蛋白印迹和半定量RT-PCR检测Survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,免疫荧光技术检测转染重组质粒pSIREN/S后Survivin基因在EC-109细胞的表达情况。在不同时间点收集转染细胞,提取细胞基因组DNA,电泳检查DNA ladder的形成;利用流式细胞术观察siRNA抑制Survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况。结果:荧光显微镜结果显示,重组质粒转染效率达46.7%。半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对Survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞Survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对Survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用。利用RNA干扰技术抑制survivin的表达,EC-109细胞的基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果显示细胞的凋亡比例显著提高。结论:重组质粒pSIREN/S对靶基因Survivin具有很好的沉默作用。靶基因在mRNA水平和蛋白质水平上均能有效地被沉默。抑制Survivin基因的表达,能有效诱导细胞凋亡的发生。本研究为下一步在体内利用重组质粒pSIREN/S沉寂Survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础。
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