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随着畜禽养殖业的迅速发展,经济效益提升的同时,也给生态发展发来压力。各类污染物处理技术相对滞后,导致仍然有许多污染物残留。畜禽粪便随意排放成为大部分水体污染的主要原因,不仅对生态环境造成损害,还会威胁到特定范围内人民群众的公共安全,演变成公共安全事件。针对畜禽粪便所造成的地表水体中普遍存在的微生物污染,从源头上给予及时有效地控制是解决问题的关键。在利用微生物进行水体粪便污染溯源的研究工作中发展了微生物源示踪(Microbial Source Tracking,MST)技术,该技术分为库依赖型和非库依赖型两种类型。主要指利用污染指示微生物本身和其特有的基因指纹或宿主特异性分子标记作为污染源的示踪指示物,通过比较受污染样品与可疑粪便源中指示物的差异或其生物指标的有无来判断是否与可疑污染源存在关联,从而确定污染来源。本实验选取大肠杆菌以及拟杆菌作为污染指示菌,利用细菌重复基因间共有序列扩增法(ERIC-PCR)、抗生素耐药性分析(ARA)和qPCR技术对污水口周边水域猪、鸡粪便污染情况进行追踪,探究养殖过程中产生的猪、鸡粪便对周围水源的影响及分析这三种技术的地区适应性,为水体污染周边地区猪、鸡粪便水体污染监测提供技术上的实践依据。主要研究内容如下:1.ERIC-PCR法追踪污水口周边水域中畜禽粪便的大肠杆菌污染本实验通过分离纯化、生化鉴定、革兰氏染色和16SrRNA等方法从采集于污水口周边养殖场猪、鸡粪便和周边污水口的水样中,分离鉴定出265株大肠杆菌。其中猪源大肠杆菌180株、鸡源大肠杆菌72株、水源大肠杆菌13株。利用ERIC-PCR方法对分离得到的大肠杆菌分别建立猪、鸡源大肠杆菌指纹图谱。由SPSS软件聚类分析得出13株水源大肠杆菌均来源于猪源粪便。Pearson相似系数的聚类分析得到的正确聚类率达82.6%。猪源判别率为93.6%,鸡源判别率66.4%。实验结果表明该方法可较好的识别猪源粪便。2.ARA法检测污水口周边水域中畜禽粪便的大肠杆菌污染及其耐药性分析对分离到的180株猪源大肠杆菌以及72株鸡源大肠杆菌采用了 ARA方法,进行了抗性指纹图谱建立。利用SPSS软件对13株水源大肠杆菌进行判别分析得出,其中12株来源于猪粪便,1株来源于鸡粪便,同源识别率(RCC)分别为99.4%、13.6%,说明该数据库猪源粪便污染的识别准确性较好,而对于鸡源的识别准确性较差。对该分析模式下的指纹图谱库的平均同源识别率(ARCC)进行分析,得到源分析的ARCC为77.8%,交叉验证后的ARCC为77.4%,结果表明猪、鸡源大肠杆菌间的抗生素抗性具有差异显著性(P<0.05),ARA法可以用于周边水域粪便污染的追踪。利用药敏纸片法对265株大肠杆菌进行6种抗生素耐药率和多重耐药性分析,结果表明猪源大肠杆菌最广可同时耐6种抗生素且对多西环素的耐药率最高为43%。该实验表明周边水域污染主要来自于猪粪便。3.拟杆菌特异性分子标记检测污水口周边水域中畜禽粪便的拟杆菌污染及其衰变分析本实验以猪、鸡源粪便构建出受粪便污染的水环境微系统,依据拟杆菌具有的宿主特异性设计引物来识别受污染水环境中猪源、鸡源以及通用拟杆菌中特异性基因标记,并据此对污染水环境中粪便污染进行qPCR定量检测。5种不同猪源拟杆菌引物的特异性引物检测表明引物4(PS422F/Bac581R)适合用于特异性检测本地区宿主为猪的拟杆菌,适用于本地区检测普通拟杆菌的特异性引物为引物1(Baac32F/Bac303R),比较后适用于本地区以鸡为宿主的特异性拟杆菌引物为引物8(chBact-F1/chBact-R16)。同时实验发现光照对拟杆菌特异性生物标记稳定性无显著性影响,而水体原有微生物对特异性生物标记的降解有促进作用。ERIC-PCR与ARA法相比,ARA法对于粪便污染的识别率更高,判别正确率更高,适用于污水口周边水域污染追踪。拟杆菌特异性生物标记法可特异性定量分析水域污染,且环境光照对标记影响较小,而水体原有微生物可促进标记降解。