目的:肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是一种革兰氏阴性肠杆菌,无鞭毛,部分血清型有宽厚荚膜,可引起肺炎、脓胸、尿路感染或菌血症。部分血清型可引起获得性肝脓肿与转移性感染眼膜炎、脑膜炎等。多项临床研究均证明糖尿病是肺炎克雷伯菌侵袭性感染的高危因素。那么除糖尿病患者机体免疫系统受到影响外,糖尿病环境对肺炎克雷伯菌本身会产生什么样的影响呢?肺炎克雷伯菌如何感受高糖的环境并适应这个环境?不同细菌均有其典型细菌形态,形态变化可调节细菌的附着和致病性,细菌可以根据宿主的环境刺激或不同的生长条件来改变其形态。目前有关肺炎克雷伯菌形态变化机制未见报道。本项目发现在高糖环境中肺炎克雷伯菌的形态发生变换,但其变化机制不明确。本研究主要探索高糖环境下肺炎克雷伯菌形态变化及细菌是如何感应高糖环境调控相关基因表达而调控细菌形态的具体分子机制。方法:首先构建II型糖尿病(T 2 DM)小鼠模型,消化道和腹腔感染肺炎克雷伯菌NTHU-2044株(K1血清型,分离于肝脓肿患者),分析糖尿病小鼠对肺炎克雷伯菌易感性的变化。同时获得不同感染组小鼠肝脏,匀浆涂片染色观察肝脏内肺炎克雷伯菌形态的变化。在此基础上体外模拟高糖培养环境观察高糖环境下细菌形态改变。细菌对糖代谢的反应受到了碳代谢整体调控因子CRP的调控,为分析在高糖情况下肺炎克雷伯菌形态改变的机制,构建肺炎克雷伯菌crp基因敲除株与回补株。通过扫描电镜分析肺炎克雷伯菌WT、crp敲除株(△crp)、crp回补株(C-crp)形态变化。蛋白组学分析受到CRP调控的蛋白质,筛选出可能受到CRP调控的与肺炎克雷伯菌细菌分裂和细胞壁合成的相关基因并通过q RT-PCR分析这些基因在高糖环境下的表达情况。挑选在高糖环境下表达上调的基因构建过表达相关基因的菌株,涂片染色观察细菌形态的变化。在此基础上,通过Lac Z报告基因融合实验及凝胶阻滞实验(EMSA)实验对CRP与相关基因的具体调控机制进行研究。最终阐明高糖环境调控肺炎克雷伯菌形态变化的具体机制。结果:相对正常小鼠,II型糖尿病模型小鼠对肺炎克雷伯的易感性明显增强。糖尿病小鼠肝脏中肺炎克雷伯菌的形态发生变化,不再成杆状而成为近似球形(1.387±0.089μm vs 2.506±0.131μm,P<0.01)。在体外高糖培养基中,肺炎克雷伯菌形态发生同样变化。相对野生株,crp基因敲除株的细菌形态也变成短圆形(0.981±0.057μm vs 2.415±0.066μm,P≤0.001),而C-crp杆状形态得以恢复。表明在感受到高糖环境后肺炎克雷伯菌可以通过调控c AMP-CRP复合物的活性而使细菌形态发生改变。比较蛋白质组学分析显示,共有1032个基因在野生株与基因敲除株中均能发现,其中426个基因的表达水平发生2倍以上的改变。在crp基因敲除株中,发现11个已证明参与细胞分裂或细胞壁生物合成蛋白质的表达发生变化,10个蛋白表达量增加。选取其中5个(omp A,tol B,ybg C,fts I and rcs F)变化水平高的基因以分析它们在细菌形态变化中的作用。通过q RT-PCR分析这5个基因在高葡萄糖环境中转录水平的变化,结果表明,在含12 m M葡萄糖的LB培养基中,rcs F、tol B和fts I的表达水平显著增加。构建分别携带有rcs F、tol B和fts I基因的表达质粒电转至野生株获得相应基因的过表达菌株。涂片染色发现Tol B与Rcs F过表达菌株细菌形态发生变化。Lac Z报告基因融合实验证明tol B与rcs F受到c AMP-CRP负调控,EMSA实验表明c AMP-CRP能够结合到tol B与rcs F启动子区,直接调控tol B和rcs F的表达。结论:(1)高糖环境可引起肺炎克雷伯菌细菌形态的变化;(2)c AMP-CRP参与调控细菌形态变化(3)c AMP-CRP通过直接负调控与细菌分裂及细菌形态变化基因tol B和rcs F的表达影响细菌形态。本研究分析了在糖尿病患者高糖环境下对肺炎克雷伯菌形态的影响及其可能的调控机制。证明在糖尿病患者中高糖环境可能会对肺炎克雷伯菌形态产生影响而影响细菌的致病力,为从细菌角度阐明糖尿病患者对肺炎克雷伯菌的易感机制提供了理论依据。