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CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于基因的功能研究以及动植物突变体的创制,而基因编辑效率的高低直接影响研究工作的难易程度和工作效率。影响基因编辑效率的因素包括驱动Cas9和sg RNA表达的启动子、编辑靶点所在基因的位置、编辑受体植物的染色体倍型等。其中研究较多同时也是影响基因编辑效率最大的因素是驱动Cas9基因的启动子,因此选用合适的启动子驱动Cas9的表达在提升基因编辑效率中显得尤为重要。在二倍体自交授粉植物中通过根癌农杆菌介导的遗传转化获得基因编辑的植株后,即使经基因编辑的靶点在植株T1代为杂合型,通过自交一代即可获得基因编辑靶点突变纯合的植株。目前在豆科植物共生固氮研究中,由于豆科植物通过根癌农杆菌进行遗传转化周期较长或转化效率很低,一般采用发根农杆菌介导的转化进行基因的功能研究。通过发根农杆菌介导的转化进行基因编辑时,分析的表型是在产生的转基因毛状根上,由于大部分的性状只有经编辑的基因产生双突/纯合突变的基因型,才能观察到相应的表型。因此通过发根农杆菌介导的转化进行基因编辑研究基因的功能,基因的编辑效率是关键因素,只有基因编辑效率高,产生的双突/纯合突变类型比例高,才有利于进行基因功能分析。本研究拟通过克隆在根中强表达的启动子驱动Cas9的表达,筛选出在根中基因编辑效率高、产生双突/纯合突变类型高的启动子。首先克隆在根中特异表达或强表达的启动子,通过发根农杆菌介导的转化,证明其在根中表达的高活性。然后构建该启动子驱动Cas9的基因编辑载体,建立了一套应用于毛状根基因编辑的CRISPR/Cas9基因编辑系统,筛选出在毛状根中基因编辑效率高、产生双突/纯合突变类型高的启动子。取得的主要结果如下:1、从大豆中扩增Gma-mi R1510b-3P的上游2173 bp启动子片段,构建Gma-mi R1510b-3P启动子驱动GUSPlus报告基因表达的重组质粒,通过发根农杆菌介导的一步转化法转化大豆并进行GUS组织化学染色分析。结果表明,Gma-mi R1510b-3P的启动子在大豆根和根瘤中有很高的表达活性。2、从拟南芥中克隆了At GCS基因上游833 bp-2411 bp长度不等的启动子,分别构建5个长度不等的At GCS启动子驱动GUSPlus报告基因表达的重组质粒,通过发根农杆菌介导的一步转化法转化大豆、番茄、黄瓜、百脉根以及多倍体作物甘薯、棉花、烟草并进行GUS组织化学染色分析。结果表明,At GCSpro2411、At GCSpro1977、At GCSpro1629、At GCSpro1178根中GUS信号活性很高且无明显差异,At GCSpro833中GUS的表达水平最低且在根尖中没有GUS信号表达,说明At GCSpro833在根尖组织中没有活性。At GCS启动子在所有转化的双子叶植物中,都能驱动GUSPlus的表达,并且其表达活性很高。这说明At GCS启动子在根中细胞分裂活跃的组织中活性很强,At GCS启动子适用于广泛的双子叶植物。3、为了初步检验不同启动子驱动Cas9的编辑效率,本研究先设计了一个sg RNA靶向大豆基因Rj7进行编辑,通过发根农杆菌介导的毛状根转化,各取30条转基因根进行检测,结果表明,启动子At GCSpro2411、At GCSpro1178、Gma-mi R1510b-3P、2×35Spro、At GCSpro833驱动Cas9编辑Rj7产生纯合/双等位突变效率分别为76.7%、70%、73.7%、56.7%和50%。这说明At GCSpro2411、At GCSpro1178和Gma-mi R1510b-3P启动子驱动Cas9的编辑效率比广泛使用的2×35Spro具有更高的编辑效率,但是截短的At GCSpro833的编辑效率比2×35Spro低,不适用于基因编辑。随后对大豆的Gm NNL1和Rfg1基因进行双靶点编辑结果表明启动子At GCSpro1178、Gma-mi R1510b-3P、2×35Spro驱动Cas9同时编辑Gm NNL1和Rfg1产生纯合/双等位突变效率分别为6.7%、6.7%和0%。综合以上结果表明At GCSpro更适用于发根农杆菌介导的转化中的基因编辑,具有较高的编辑效率。4、为了验证At GCSpro在其它双子叶植物中的毛状根转化中是否同样具有较高的编辑效率,对百脉根Lj NLP4和Lj SYMRK基因、番茄Sl TRY基因进行双靶点编辑,结果表明At GCSpro比2×35Spro驱动Cas9进行基因编辑产生的纯合/双等位突变效率高1.7倍和8.3倍。综上所述,通过本研究筛选出了在毛状根中高表达的启动子,建立了适用于发根农杆菌介导的毛状根转化的高效的CRISPR/Cas9基因编辑体系,为基因功能研究、基因工程改造奠定了良好的基础。