目的:蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)的干燥表皮中存在多种有效的化学成分统称为蟾毒内酯,该成分为一类具有相同甾体骨架的内酯类稠环化合物,其中包括华蟾酥毒基、酯蟾毒配基和蟾毒灵。药理学研究表明蟾毒内脂具有抗肿瘤、强心、阵痛、抗炎等作用而得到广泛研究。目前临床常用剂型为传统的片剂、口服液、胶囊和注射剂等等,但是口服片剂、胶囊剂服药量比较大,患者顺应性差;口服液口感差具有腥臭味;注射剂刺激静脉。随着科学的发展,新型制剂因其广泛优点得到广泛重视,因此,研究蟾皮提取物有效成分的新型制剂,改善现有剂型不足很有必要。固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)是以固态的天然或合成的类脂如单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、三酰甘油等为载体,将药物包裹于类脂核中经不同方法制成的粒径在50~1000 nm之间的固态胶粒给药体系。这种新型给药载体使用无生物毒性的脂质作为基质,同时具备纳米粒的物理稳定性高、可控制药物释放以及良好的靶向性等优势,又兼具了脂质体、乳剂的毒性低、能大规模生产的优点,其发展前景非常广阔。本课题拟从蟾皮中优化提取有效成分,并以所提取物为原料药物制备蟾皮提取物固体脂质纳米粒,目的是控制药物释放和药物靶向、增加药物的稳定性和载药量,增强患者对用药的顺应性。方法:建立HPLC方法测定蟾皮提取物中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量,并进行方法学验证试验。优化蟾皮提取工艺,考察干燥蟾皮浸泡时间对提取率的影响,考察水提醇沉和乙醇煎煮回流方法获得蟾皮提取物的优劣。确定采用传统的乙醇煎煮回流法后,以乙醇浓度、煎煮次数、煎煮时间进行三因素三水平的正交试验,以提取所得浸膏量及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量为评价指标,采用综合加权评分方法筛选得到最佳提取工艺,并对最优工艺进行验证试验。对所得蟾皮提取物浸膏进行质量评价。采用薄层色谱法对提取物进行了定性鉴别,采用HPLC方法测定提取物中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量。在单因素试验基础上对油水相加入顺序、油相的加入方式、超生条件、乳化时间、冷却方式、外水相分散剂的种类和浓度比例、投药量和油相中乙醇浓度进行处方和制备工艺的单因素考察,筛选固体脂质纳米粒的制备方法,采用均匀设计优选蟾皮提取物固体脂质纳米粒的制备工艺。对所得蟾皮提取物固体脂质纳米粒进行质量评价,采用显微镜和透射电镜下观察纳米粒形态、测定粒径以及测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基包封率和载药量等方法评价纳米粒的质量。将制备的纳米粒置于60℃、25℃、4℃,分别于0 d、3 d、6 d、12 d、24 d取样观察并测定包封率,进行稳定性考察。结果:华蟾酥毒基标准曲线方程为:A=36793C+743.9(r=0.9990,n=6)。酯蟾毒配基标准曲线方程为:A=28149C+2084.5(r=0.9990,n=6)。华蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高三种浓度的日内精密度RSD分别为2.95%、1.04%、2.92%和2.92%、3.03%、2.41%;日间精密度RSD分别为6.28%、1.96%、2.67%和6.18%、3.51%、2.78%。华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的平均加样回收率结果达分别为97.77%和98.31%。24h内华蟾酥毒基峰面积的RSD值为1.079%,酯蟾毒配基峰面积的RSD值为2.836%。正交试验筛选乙醇煎煮回流法,得到最佳提取工艺为:10倍量80%的乙醇,煎煮三次,每次20 min。薄层色谱结果显示,所得浸膏中含有华蟾酥毒基和酯蟾毒配基。蟾皮提取物浸膏中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的平均值分别为华蟾素毒基2.124 mg/g,酯蟾毒配基1.122 mg/g。单因素试验中根据包封率和载药量:油相加入到水相明显好于水相加入油相、并且滴入高度选择为液面上5 cm左右,缓慢滴入。超声条件定为:功率400W、间歇20s、总4min、乳化时间为150 min。冷却选择先冰浴搅拌15 min然后转移置于冰箱的冷却方式。选用P188和吐温-80混合分散剂(比例5:1),纳米粒稳定性好,在显微镜下观察纳米粒分布均匀。采用均匀设计试验优选得到制备蟾皮提取物纳米粒最优处方为:ATO 100mg、大豆卵磷脂300mg、药物300 mg加入到5%P188 42ml和0.5%TWeen-80 8ml混合分散剂中乳化150 min。按优化处方制得的固体脂质纳米粒呈乳白色,用透射电镜观察形态,可见所得粒子大小均匀,呈球形或椭球形,激光散射粒度分析仪测得平均粒径为(138.5±4.2)nm,90%粒径小于(208.1±27.9)nm,多分散性指数为0.143±0.023。稳定性研究结果显示,随着放置温度的升高和放置时间的延长,蟾皮提取物纳米粒的包封率逐渐下降,颜色由乳白色转变为淡黄色,其中4℃放置24d包封率尚在80%以上。结论:采用HPLC方法测定蟾皮提取物中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量,方法可行,专属性好。乙醇浓度是影响蟾皮中脂溶性成分提取工艺的最主要因素,正交设计验证试验表明该方法浸膏得率很高、有效成分含量也较高,重复性也好,采用多指标综合评价法优化蟾皮脂溶性成分提取工艺合理、可行。本实验制备的蟾皮提取物固体脂质纳米粒具有非常好的包封率和载药量,并且粒径小分布均匀,制备工艺的重现性和稳定性良好,所建立的质量控制标准稳定可靠。蟾皮提取物固体脂质纳米粒应低温条件下保存。