细胞色素P450是生物体一类重要的代谢解毒酶,P450通过代谢内源和外源物质参与昆虫的取食、生长、发育、生殖以及防御等生理活动,在昆虫适应外界环境、抗药性产生等方面扮演重要角色。P450亚家族CYP4G起源于昆虫祖先由水生环境向陆生环境的转变期,具有合成表皮烃类物质阻止水分散失和维持体内水平衡的重要功能,对于昆虫适应低湿环境至关重要。近年来研究发现,部分昆虫CYP4G亚家族的功能可能出现了分化,可能具有调控昆虫生长发育等功能,但机制尚不明确。桔小实蝇环境适应能力强,寄主范围广,可对多种水果蔬菜造成严重的危害。桔小实蝇的适生范围近年来迅速扩大,有逐渐向高纬度低湿度地区扩散的趋势,说明桔小实蝇对低湿度环境有较强的适应能力。探索CYP4G亚家族是否影响桔小实蝇对干燥环境下的适应能力对揭示其快速扩张的机制,以及制定相应的防控策略等有重要的参考意义。此外,鉴于CYP4G作为保守直系同源基因已出现功能分化现象,探究其承担的其他生理功能可为防控桔小实蝇提供潜在的新靶标。因此,本学位论文以桔小实蝇为研究对象,在注释获得桔小实蝇全基因组P450并解析其表达模式的基础上,综合运用RNAi、表达谱测序、GC/MS、超景深三维显微成像、异源表达等技术和手段,揭示CYP4G100调节表皮烃类化合物合成的CYP4G亚家族保守功能;系统观察明确桔小实蝇围蛹的发育过程并建立围蛹发育分级标准;探究CYP4G188通过调节蜕皮激素滴度介导桔小实蝇蛹-成虫蜕皮的分子机制。主要研究结果如下:1桔小实蝇P450全基因组鉴定与表达模式解析利用桔小实蝇基因组数据以及本地转录组数据库,注释获得101个P450基因信息。序列分析显示所有基因均具有Helix-C、Helix-I、Helix-K、PERF和Heme-binding等5个P450蛋白保守结构域。系统发育分析结果显示,桔小实蝇P450分为CYP2、CYP3、CYP4和CYPmito4个集团,各集团分别由7个、46个、32个和16个P450基因组成。这些P450可进一步分为25个家族57个亚家族,其中最大的家族由31个基因组成,最小的家族仅由1个基因构成。在基因组scaffolds上对这些P450进行定位发现,59个P450以基因簇的形式出现在scaffolds上,说明桔小实蝇P450在进化中出现由复制引起的基因扩增现象。进一步利用q PCR技术解析P450基因在不同发育阶段和成虫不同组织的表达模式,发现超过一半的P450基因在成虫期高表达,部分基因在幼虫和蛹期丰度较高,仅9个P450基因在卵期高表达;绝大多数P450基因在成虫脂肪体、中肠和马氏管等代谢组织表达量较高,少数基因在卵巢中特异性高表达。在桔小实蝇全基因组P450注释中,获得CYP4G亚家族基因3个:CYP4G100、CYP4G101和CYP4G188。克隆获得3个CYP4G基因的c DNA序列,分析发现其均具有CYP4G亚家族特征插入序列。通过与其他昆虫CYP4G进行系统发育分析发现,CYP4G聚为两枝,桔小实蝇CYP4G100与CYP4G101聚为一枝,CYP4G188在另外一枝。CYP4G100与CYP4G101的表达模式相似,均在羽化前期、成虫期以及成虫脂肪体中高表达,这与其他昆虫中调节表皮烃合成的CYP4G基因表达模式高度一致,但CYP4G101的实际表达丰度极低。CYP4G188则仅在围蛹中期(化蛹后第5天)特异性高表达,暗示桔小实蝇CYP4G亚家族成员功能出现分化。2桔小实蝇CYP4G100调节表皮烃合成干燥环境处理(相对湿度RH<10%)可显著诱导桔小实蝇CYP4G100基因表达上调。利用注射法RNAi,沉默CYP4G100表达后,可阻断桔小实蝇表皮烃合成过程,造成几乎所有种类表皮烃含量极显著下降,同时合成烃类底物的甘油酯含量显著积累;与此同时,沉默CYP4G100后的桔小实蝇在干燥环境中失水率显著上升,并导致死亡。上述结果说明,CYP4G100通过调节表皮烃的合成进程从而影响桔小实蝇对干燥环境的适应能力。3桔小实蝇CYP4G188影响蛹-成虫蜕皮进程CYP4G188在桔小实蝇围蛹发育至第5天时特异性高表达,表明该基因的功能很可能与围蛹发育有关。通过系统观察并描述桔小实蝇围蛹发育的形态学特征,根据幼虫-蛹蜕皮、头外翻、蛹-成虫蜕皮、复眼颜色变化等围蛹发育中的形态学变化,建立了围蛹发育的分级标准,并将桔小实蝇围蛹发育分为6个阶段:幼虫弃食期、幼虫-蛹蜕变期、隐头蛹期、显头蛹期、隐成虫期和羽化期。采用高通量表达谱测序筛选了与CYP4G188表达模式一致和相反的基因,通过对这些基因功能聚类(GO、KEGG),推测CYP4G188很可能调节围蛹发育中蛹-成虫蜕皮过程。据此,在成功构建桔小实蝇围蛹注射法RNAi技术体系的基础上,沉默CYP4G188表达,发现桔小实蝇蜕皮激素滴度显著增加,蛹-成虫蜕皮提前完成。比较分析外源蜕皮激素处理与沉默CYP4G188后的围蛹外部形态表型发现,两种处理均导致围蛹中期发育加速,复眼颜色变化明显提前,但对成虫羽化率和羽化时间没有影响。4 CYP4G100与CYP4G188的异源表达与活性检测基于p-Cold II构建原核表达载体,使用添加稀有密码子的Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主的原核表达系统,成功表达出CYP4G100和CYP4G188可溶蛋白,但经CO差光谱分析,重组蛋白仅在420 nm处有吸收峰,无P450活性。基于p Fast-HT A载体构建的Bac-to-Bac真核表达系统未成功表达出目的蛋白。综上所述,本学位论文研究结果揭示了桔小实蝇CYP4G100具有CYP4G亚家族的保守功能,通过调节表皮烃的合成过程进而影响桔小实蝇对干燥环境的适应能力;CYP4G亚家族功能分化的CYP4G188则通过负调节桔小实蝇围蛹发育中蜕皮激素滴度而影响蛹-成虫蜕皮过程。上述两个CYP4G亚家族基因功能的研究对于了解桔小实蝇适应干燥环境的机制,延缓桔小实蝇的扩散具有重要的参考价值,有关CYP4G基因调节桔小实蝇的变态发育过程的功能,为新型特异性防控药剂的研发提供了作用靶标。此外,本研究建立的桔小实蝇围蛹发育的分级标准对于田间准确的预测预报提供了技术指标。