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【研究背景】随着社会的发展进步,抑郁症的发病率在逐年提高,已经给社会造成了严重的负担。抑郁症治疗的主要手段是药物和心理干预。最近有文献指出,运动作为一种健康有效的抗抑郁治疗方式,越来越受到大家的重视。Carrard等在2018年的研究发现,外周注射L-乳酸（L-lactate,LA）具有抗抑郁作用,而乳酸（Lactate）是运动过程中大量产生的代谢终产物。因此,我们联想到,乳酸可能是运动抗抑郁的调节因素。那么乳酸发挥抗抑郁作用的机制是什么呢?抑郁症的发病机制仍然是众说纷纭,但有不少研究报道,中枢神经系统的炎症发生可能是导致抑郁症产生和发病的关键原因之一。近期,有关于炎症诱导抑郁样行为发生的报道指出,高迁移率族蛋白-1（High mobility group box-1,HMGB-1）被认为是一种可以引起抑郁发生的重要炎症分子。HMGB-1是一种表达丰富且可迁移的核蛋白,在大多数细胞类型中都有表达,并与许多炎性疾病有关。有不少报道指出,细胞在受到应激后,HMGB-1会大量从细胞核中释放到细胞外环境中,并通过结合其他细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRRs）,例如toll样受体（TLR-4）,激活炎症反应的发生,参与抑郁症的发病过程。海马组织（Hippocampus）是抑郁症研究中最常被研究的大脑区域。神经源性假说认为,重度抑郁症（Major depressive disorder,MDD）与成年海马组织的神经元发生障碍有关。神经元（Neurons）在中枢神经系统中执行最基本的功能,如信号传输和网络整合,并且是情绪记忆障碍类疾病的主要靶标。神经元是中枢神经系统中主要表达HMGB-1的细胞之一。那么,若神经元接受应激信号后,是否会通过HMGB-1诱导中枢神经系统的炎症发生呢?小胶质细胞（Microglia）是中枢神经系统中参与炎症反应的主要细胞之一。小胶质细胞的细胞膜上会表达各种PRRs,例如TLR-4等。当机体受到压力或应激后,这些受体可以接受应激信号,激活一系列的炎症反应,例如激活核因子（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）磷酸化,诱导炎症小体NOD样受体3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）、凋亡相关微粒蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）、天冬氨酸蛋白水解酶-1（Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1）或者炎症因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）,肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor,TNF-α）的表达升高,最终导致抑郁症的发生。【研究目的】1.HMGB-1是否是抑郁样行为发生的调控因素?2.神经元HMGB-1是否在小胶质细胞炎症分子升高中起了调控作用?3.LA是否通过抑制HMGB-1的表达产生抗抑郁作用?【方法】1.C57BL/6小鼠腹腔给予不同浓度的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（0.4、0.5、0.7、0.8 mg/kg）建立LPS抑郁模型。对小鼠进行抑郁样行为学测试:悬尾试验（Tail suspension test,TST）,强迫游泳（Forced Swimming Test,FST）,蔗糖偏好试验（Sucrose preference test,SPT）,以验证模型是否成功构建,并检测小鼠海马HMGB-1、TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β、TNF-α等炎症指标的表达。2.探究腹腔给予不同浓度（20、30、40 mg/kg）的HMGB-1抑制剂甘草酸（Glycyrrhizic acid,GZA）对LPS小鼠抑郁模型的行为学和海马组织HMGB-1的影响。3.探究不同浓度GZA对LPS小鼠抑郁模型海马区TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1表达的影响。4.探究LPS处理神经元后对HMGB-1表达和释放的影响。随后,收集神经元上清,观察其对小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达和IL-1β、TNF-α的影响。5.体外培养原代神经元和小胶质细胞,探究GZA对LPS处理神经元后HMGB-1的表达和释放的影响?收集神经元上清,观察其对小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的影响。6.探究HMGB-1 sh RNA干扰神经元HMGB-1表达后是否影响LPS对神经元HMGB-1的作用。收集神经元上清,观察是否能影响小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达。7.探究人重组HMGB-1（r-HMGB-1）对小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白和IL-1β、TNF-α的影响。8.探究LA对LPS抑郁模型行为学,HMGB-1、TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白和IL-1β、TNF-α的影响。【结果】1.腹腔给予不同浓度的LPS（0.5,0.7,0.8 mg/kg）可以不同程度地诱导小鼠抑郁样行为的发生。且给予0.5 mg/kg的LPS不同时间点后可以不同程度诱导海马组织HMGB-1、TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β、TNF-α表达升高（p<0.05）。2.GZA预处理三天显著缩短了LPS抑郁模型悬尾试验,强迫游泳试验中小鼠的不动时间,以及提高了蔗糖偏好试验中小鼠的蔗糖消耗率（p<0.05）。且降低了LPS诱导的海马组织中HMGB-1蛋白表达的升高（p<0.05）。3.GZA预处理降低了LPS诱导的海马组织中TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的升高（p<0.05）。4.LPS可以诱导神经元HMGB-1表达和释放的升高（p<0.05）。免疫荧光结果显示,随LPS处理神经元时间的增加,细胞核HMGB-1的分布降低,细胞质HMGB-1分布升高。且LPS处理神经元后的上清可以诱导小胶质细胞TLR-4、NLRP3、P-NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表达的升高（p<0.05）。5.25,50 ng/m L的GZA均能抑制LPS诱导的神经元HMGB-1的释放升高（p<0.05）。50 ng/m L的GZA可以抑制LPS诱导神经元HMGB-1表达升高,导致其上清无法诱导小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的升高（p>0.05）。6.HMGB-1 sh RNA可以抑制LPS诱导的神经元HMGB-1表达和释放的升高。导致上清无法诱导小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的升高（p>0.05）。7.r-HMGB-1处理小胶质细胞使TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达升高（p<0.05）以及上清中IL-1β、TNF-α的含量升高（p<0.05）。8.LA可以使LPS抑郁模型悬尾试验和强迫游泳试验中的不动时间显著降低（p<0.001）,以及糖水消耗率显著升高（p<0.01）;同时也抑制了LPS抑郁模型HMGB-1、TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1（p<0.05）和炎症因子IL-1β、TNF-α的表达（p<0.05）。9.不同浓度的LA均能抑制LPS诱导的神经元上清中HMGB-1浓度的升高（p<0.05）。我们选择30m M的LA进行后续实验,Western blot显示,30m M的LA能抑制LPS诱导的神经元HMGB-1蛋白的升高（p<0.05）。10.LA可以抑制LPS处理神经元的上清诱导小胶质细胞TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1（p<0.05）和IL-1β、TNF-α的升高（p<0.05）。【结论】1.动物水平上,LPS可以诱导小鼠的抑郁样行为和HMGB-1以及炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。细胞水平上,LPS可以诱导神经元释放HMGB-1介导小胶质细胞炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1表达升高。2.动物水平上,降低HMGB-1的表达可以缓解小鼠抑郁样行为和炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。细胞水平上,降低神经元HMGB-1的表达可以抑制小胶质细胞炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。使用r-HMGB-1可以诱导小胶质细胞炎症蛋白表达升高,说明HMGB-1可以调控这些炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。3.动物水平上,LA可以抑制LPS诱导的小鼠抑郁样行为和HMGB-1以及炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。细胞水平上,LA可以抑制LPS诱导神经元释放HMGB-1,从而抑制小胶质细胞炎症蛋白TLR-4、P-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1表达升高。