果品安全生产是我国水果产业目前面临重大挑战之一,农业部“两减”政策的推出进一步凸显这一需求,因此增加有机肥料(包括氨基酸叶面肥)的施用已成为果树栽培的必然选择。随着我国畜禽产业的迅猛发展,每年的羽毛废弃物也逐年增加,在这个背景下,利用废弃羽毛生产氨基酸肥,不仅解决了环境污染问题,还能促进果品的安全生产,显然有着良好的应用与推广价值。因而本论文的研究以羽毛角蛋白降解菌为核心,进行降解菌的分离、筛选,揭示降解菌的分子生态特征,高效菌株发酵产物的初步应用和优化,并进一步开展关键酶的克隆和表达,为更好的利用羽毛角蛋白降解菌提供理论依据,本论文主要研究结果如下:1)利用常规土壤添加羽毛诱导富集以及选择养鸡场内羽毛堆放土壤进行分离,共计得到40株羽毛角蛋白降解菌。其中,9株来自富集后的常规土壤、31株来自养鸡场土壤。因此利用羽毛角蛋白作为诱导物在土壤中进行富集,或者在角蛋白废弃物场都可成功分离到角蛋白降解菌。基于16S rDNA序列构建的系统发育树表明,这40株菌从属于4个门类,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)以及拟杆菌门(Bacteroidetes),前两者属于革兰氏阳性菌,后两者属于革兰氏阴性菌,其中以属于厚壁菌门的芽孢杆菌数量最多。2)在分离到的羽毛降解菌中,菌株205经形态观察和16S rRNA基因测序初步鉴定为芽孢八叠球菌属,是芽孢八叠球菌利用羽毛进行生长的首次报道,进一步结合细菌鉴定发现其为一株新菌,为微生物降解利用家禽羽毛角蛋白提供了新的种质资源。将该株菌205命名为广州芽孢八叠球菌(Sporosarcina guangzhouensis GIMN1.015~T),保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M2011367。3)在筛选试验中,我们得到4株高羽毛降解活性的菌株,均能以羽毛为唯一碳氮源进行生长,羽毛降解率达到90%以上,几乎可完全降解包括羽轴在内的完整羽毛。对羽毛发酵后的氨基酸原液进行成分分析,发现含有17种氨基酸种类,总氨基酸含量达3.84mg/m L,此外还检测到含有多种的植物激素。进行柑橘和生菜的盆栽试验,结果表明喷施中浓度氨基酸可显著提高柑橘梢长,改善柑橘叶片生长状况。而不同氨基酸肥处理都使生菜地上部生物量(鲜重和干重)得到了增加,鲜重增加为20.8~32.7%不等,喷施高浓度氨基酸可提高生菜叶片中的可溶性蛋白和VC含量(分别比清水对照提高了35.3%和13.3%)。此外叶面喷施氨基酸肥处理与尿素处理相比可显著降低生菜叶片的亚硝态氮含量。4)搜索角蛋白酶基因,结合CODEHOP数据库进行简并引物搜索和设计,利用已经分离到的40株羽毛降解菌以及10株无羽毛降解能力的模式菌株进行引物的验证。利用该特异性引物进行PCR-DGGE分析和荧光定量,结果表明外源羽毛的添加对角蛋白酶编码基因的表达量影响巨大,对于常规土壤来源的菌株影响远大于羽毛长期积聚土壤来源的菌株,可显著提高前者的角蛋白酶编码基因表达量以及角蛋白降解菌的物种多样性。测序结果显示,检测到的条带主要来源于放线菌以及粘细菌2大类,而这些微生物类群几乎没有相关角蛋白降解的报道,表明这些都是新的角蛋白酶基因来源,值得进一步深入研究。5)利用TAIL-PCR进行角蛋白酶全长ORF的Genome walking扩增,获得了两个菌株(菌株205和菌株6-16)丝氨酸角蛋白酶编码基因的全长ORF序列。对获得的序列进行生物信息学分析,发现克隆到的菌株205和6-16的角蛋白酶基均属于subtilisin家族,且都含有丝氨酸蛋白酶的催化三联体(Asp,His和Ser活性位点),与以往的大多数角蛋白酶分析结果相符合。将两者编码区克隆至原核表达载体pET28a-EGFP上,并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3),筛选获得重组菌,利用His标签纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析表明两者编码的角蛋白酶大小分别为45 kDa和35 kDa。6)为了进一步优化高效羽毛降解菌的发酵条件,获得产量最高的角蛋白酶,我们利用响应面法对高效降解菌株(菌株3-2和6-16)进行培养条件的优化,通过OVAT进行单因素试验,从羽毛含量、培养温度和起始pH三个因素对产酶条件进行响应面优化,拟合响应面二次模型验证值和预测值之间的误差分别为7.19%和3.76%,为高效菌株的产业应用奠定了基础。