常用的骨移植物包括自体骨、同种异体骨、人工骨。自体骨和同种异体骨移植存在相应的缺点,限制了其应用。近年来,围绕人工骨替代材料,科研人员进行了广泛而深入的研究,希望最终可以替代自体骨和同种异体骨。目前人工骨替代材料主要有两种:一、人工无机材料,如磷酸钙、硫酸钙陶瓷。磷酸钙陶瓷包括羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)和β-磷酸三钙(beta-tricalcium phosphate,β-TCP),临床上已广泛使用;二、有机高分子材料和磷酸钙的复合材料,可以负载活性因子。有机高分子材料包括天然生物衍生材料和人工合成的高分子材料。明胶(gelatin,Gel)由动物胶原蛋白经过加工制得,与正常骨基质中氨基酸组成相似,在骨组织再生工程中被广泛使用。但是,普通的明胶水凝胶由于溶胀率高、力学性能差、体内降解快,难以单独在临床应用。磷酸八钙(octacalcium phosphate,OCP),在体内是HA的重要前驱体,近年来研究表明其具有高度的骨传导性、良好的生物相容性和一定的骨诱导性,并有与骨形成速度匹配的降解率。但是OCP粉末力学性能差,且在水溶液中不稳定,容易向HA转化。将Gel和OCP混合制备复合材料可以很好地解决这一问题。骨替代材料在体内的血管化是移植物最终被降解和新骨替代的必然过程。怎样加快骨替代材料在体内的血管长入是关系骨移植手术成败的关键。血管内皮细胞生长因子(VEGF)具有良好的诱导内皮细胞生长和新生血管形成的作用,KLTWQELYQLKYKGI(QK)是VEGF的模拟肽,经证实有类似的生物学活性。但是简单混合制备的复合材料容易产生多肽分子“突释”释放且持续时间短暂,可能产生副作用。β-环糊精(beta-cyclodextrin,β-CD)广泛用作各种药物控释、缓释的载体,经过丙烯酸修饰的β-CD(Ac-β-CD)能明显改善其载药及控释性能。本文旨在构建能缓慢持续释放VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶材料,体外评估材料的结构、力学性能、生物相容性及负载QK多肽的效率和释放效果,并在体外和体内实验中考察这一复合材料的促成骨、骨修复作用。本研究共分为三个部分:第一部分,负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶的制备及表征;第二部分,负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶的体外生物相容性表征;第三部分,负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶的体内性能研究。第一部分负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶的制备及表征[目的]选用HA前驱体磷酸八钙(OCP)与具有良好生物相容性的明胶(Gel)为基础材料,加入丙烯酸修饰的β-环糊精(Ac-β-CD),改善复合材料负载及控释QK的性能。研究复合材料的形态结构表征、力学性能、体外矿化性能及负载、释放QK的性能。[方法]配制Na2HP04溶液与Ca(CH3COO)2溶液,通过均相沉淀法制备OCP粉末,通过FTIR、XRD、SEM及TEM观察并测量其表征。通过β-CD和丙烯酸合成Ac-β-CD,然后制备Gel(G)水凝胶。以1ml的水凝胶溶液为例,称取100mg Ac-β-CD和80mg Gel,加入0.9 mL PBS及0.1 mL的12959(0.5%)溶液,在37℃下涡旋混匀,超声去气泡,加入模具中,在紫外线(365 nm)下光照30min。制备Gel/OCP(GP)复合水凝胶时先将10mg OCP粉末溶于0.1ml的12959(0.5%)溶液中,然后加入至上述溶液中按步骤制备。通过光学显微镜及SEM观察材料内部结构,通过浸水实验对材料的尺寸稳定性进行表征,通过万能力学试验机对材料进行力学性能测试。将制备的材料浸泡在SBF模拟体液中2周,观察其体外矿化性能。将材料浸泡于2mg/ml的QK溶液中,12小时后取出制备负载QK的水凝胶材料,然后再将材料置于PBS溶液中检测其对QK的释放性能。通过Micro BCA试剂盒和酶标仪测定溶液中QK的浓度,从而计算材料对QK的载药率及累积释放曲线。[结果]通过FTIR、XRD检测到OCP的特征吸收谱带和晶面特征峰,证明成功制备了 OCP,其在SEM、TEM下表现为典型的薄片状结晶形态。制备的G和GP水凝胶在显微镜和SEM下为三维网络结构,有较高的孔隙率,GP表面更为粗糙。GP相对于G水凝胶浸水后的直径变异率显著变小,湿态下的压缩强度有显著提升,体外矿化时表面形成的羟基磷灰石(HA)晶体也更多。GP水凝胶对QK的载药率为49.6±1 5.8%,也好于G,两者对QK均有较好的控释性能,其差异不大。[结论]本实验成功制备了 OCP晶体,添加OCP的Gel/OCP复合水凝胶具有较好的内部孔隙结构、尺寸稳定性、力学性能和体外矿化性能。其含有的β-CD基团,使材料对QK具备良好的载药和控释功能。第二部分 负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶的体外生物相容性表征[目的]观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)和人血管内皮细胞(HUVEC)在Gel/OCP复合水凝胶材料上的黏附、生长和增殖情况,以研究材料的的生物相容性问题及体外毒性。通过成骨诱导分化培养研究材料的体外促成骨性能。[方法]根据是否添加OCP和是否负载QK,在48孔培养板上制备了 Gel(G)、Gel/OCP(GP)、Gel-QK(GQ)及 Gel/OCP-QK(GPQ)四组水凝胶材料。将 BMSC和HUVEC制成1×105个/mL的细胞悬液,接种于培养板,培养3小时,用普通显微镜和SEM观察细胞形貌。在细胞悬液中加入Dil荧光染色剂,接种于培养板,BMSC培养3天通过激光共聚焦显微镜观察细胞在水凝胶上的生长情况,HUVEC培养2天通过倒置荧光显微镜进行观察。在培养板上加入成骨诱导培养基分别制备出G、GQ、GP和GPQ四组材料的浸提液,以成骨诱导培养基作为对照组,以非成骨诱导培养基作为未诱导组。将BMSC接种于培养板,每天用新鲜的浸提液更换。培养7天后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,21天后进行茜素红染色表征材料的体外成骨性能。[结果]四组水凝胶材料均可良好的支持BMSC和HUVEC的生长。SEM观察BMSC在材料表面良好的黏附生长,激光共聚焦3D成像发现BMSC不仅可在材料的表面生长,并有向材料内部渗透生长的趋势。光学显微镜下发现HUVEC呈现出较为典型的椭圆形形态,快速增殖,铺满整个水凝胶。倒置荧光显微镜成像也证实了HUVEC可在材料表面良好生长。成骨诱导实验发现,负载QK的相对于未负载的和掺入OCP的相对于未掺入的水凝胶材料,7天的ALP表达和21天的钙结节数量明显增加。[结论]负载QK的Gel/OCP复合水凝胶在体外具有良好的生物相容性,可较好地支持BMSC和HUVEC在材料表面的黏附、生长,具有良好的体外成骨性能。第三部分负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶的体内性能研究[目的]考察负载VEGF模拟肽的Gel/OCP复合水凝胶材料的体内促血管形成能力和对大鼠颅骨缺损的修复能力。[方法]根据是否添加OCP和是否负载QK,制备了 Gel(G)、Gel/OCP(GP)、Gel-QK(GQ)及Gel/OCP-QK(GPQ)四组水凝胶材料,材料制成圆片状,直径5mm,厚1mm。使用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型作为体内成血管实验模型。将受精蛋孵育7天,在气室处开窗,揭掉蛋膜暴露鸡胚绒毛尿囊膜。将鸡胚随机分为实验组(G、GQ、GP、GPQ四组)和对照组各4只鸡胚。实验组将四组水凝胶圆片放到尿囊膜上,对照组不放材料。封口后继续孵育48h。观察尿囊膜上血管的变化,拍照记录,统计血管发育情况及相对血管长度来评价各组的促血管生长作用。取健康SD大鼠30只,分为6组。正常组不做处置,其余大鼠在左右顶骨各作一5mm骨缺损,空白组不植入材料,余四组分别植入G、GQ、GP和GPQ材料,在术后8周和16周后取材,进行Micro-CT检测及HE染色观察缺损区的骨形成情况。在术后16周时,颅骨取出前,配制墨汁灌注液,对伴随新骨形成的血管进行标记。[结果]负载QK的GQ组和GPQ组表现出明显的促CAM血管生成作用,有较大的相对血管长度。颅骨缺损修复术后8周时,Micro-CT发现四组水凝胶均有较多的新骨形成,不仅在材料与天然骨交界处,在缺损中央也可见新生骨形成。HE染色也证实上述发现,但四组均观察到未降解的材料。添加OCP的GP组和GPQ组新骨形成较多。术后16周时,空白组仍未见较好的骨修复效果。实验组具有较好的骨修复效果,材料降解明显。尤其是GPQ组,可以看到新骨以基本完全取代了水凝胶材料,但新骨的厚度与天然骨还有差异。通过墨汁灌注法发现负载QK的GQ组材料中央聚集有大量新生血管;GPQ组新生骨面积较大,其中有少量血管分布,与天然骨较为接近。[结论]负载QK的水凝胶材料具有良好的促体内血管再生作用。本实验制备的水凝胶材料可以随着移植时间的延长逐步降解,同时新骨可在材料与骨界面以及材料内部形成。负载QK的Gel/OCP复合水凝胶可作为一种优良的骨修复替代材料。