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目的:表皮干细胞治疗烧伤创面是研究热点,但离体表皮干细胞功能异常是当前研究瓶颈。近期研究发现,HOTAIR（lnc RNA）可逆转干细胞复制性衰老,维持细胞增殖和多向分化潜能;但其对表皮干细胞的作用尚未有研究提及。当前,包括本课题组在内的研究显示,HOTAIR与表皮组织发育、创面修复密切相关。本文在此基础上采用慢病毒双向调控系统、体外细胞功能实验和qRT-PCR等技术在细胞学水平探究HOTAIR与表皮干细胞的具体调控关系;并在后续的动物实验中,进一步分析靶向调控HOTAIR后的表皮干细胞对创面愈合的影响。为进一步寻找烧伤创面治疗新靶点提供新思路和理论基础。方法:1.获取深Ⅱ度烧伤患者的创面组织及植皮时剩余的正常皮肤组织,通过采用Trizol法提取总RNA,后经qRT-PCR法检测各组织中HOTAIR mRNA表达情况。2.表皮干细胞的分离培养:从健康清洁级雌性BALB/c小鼠躯干部皮肤获取皮肤组织,经胰蛋白酶消化、Ⅳ型胶原黏附贴壁得到表皮干细胞。取第2代对数生长期细胞用于后续实验,（1）～（5）。（1）表皮干细胞的鉴定:利用倒置显微镜观察细胞的形态和生长情况;并通过流式细胞仪检测细胞表面标志分子CD14、CD34、CD44、CD45的表达情况。（2）慢病毒转染并分组:通过构建HOTAIR慢病毒过表达/干扰质粒载体,转染表皮干细胞,干预表皮干细胞中HOTAIR的表达;并利用qRT-PCR检测HOTAIR表达并分组:pc-HOTAIR组、pc-vector组、sh-HOTAIR组、sh-NC组和con-ESCs组。（3）MTT检测:取上述细胞,在接种后的24 h、48 h、72 h和96 h加入MTT检测各组细胞490 nm波长处的光密度（OD）,分析表皮干细胞的增殖能力。（4）BrdU掺入实验:上述细胞接种10 d后,通过BrdU掺入实验,计算BrdU阳性细胞率,分析表皮干细胞的增殖能力。（5）qRT-PCR检测CK10、NAOG mRNA表达:细胞接种后的24 h、48 h、72 h和96 h,通过qRT-PCR检测各组细胞中CK10表达情况;细胞接种10 d后,通过qRT-PCR检测各组细胞中NANOG表达情况。分析表皮干细胞的分化能力。3.构建深Ⅱ度烫伤创面:取健康清洁级雌性BALB/c小鼠,将直径10 mm、温度达100℃的铜质圆片紧贴皮肤表面,制成深Ⅱ度烫伤创面（下称烧伤）（病理切片证实）。取上述小鼠用于后续实验,（1）～（2）。（1）取12只小鼠,12个创面,按随机数字表法于伤后0、3、7、14 d分别取3只小鼠处死,获取创面组织,通过qRT-PCR法检测创面组织各时间点中HOTAIR mRNA表达情况。（2）取80只小鼠,按随机数字表法将致伤小鼠分为pc-HOTAIR组,pc-vector组,con-ESCs组和control组,每组20只小鼠、20个创面。于伤后0（即刻）～2 d,每组小鼠每个创面接受皮下注射1次/d,4组注射的基础溶液均为20μL PBS,其中pc-HOTAIR组PBS中含0.8×10~6个/m L HOTAIR过表达的的ESCs、pc-vector组PBS中含0.8×10~6个/m L HOTAIR过表达空载的ESCs、con-ESCs组PBS中含0.8×10~6个/m L空白表达的ESCs、control组PBS中不含任何其他物质。按随机数字表法于注射0（即刻）、3、7、14 d每组分别取5只小鼠大体观察创面愈合情况并计算创面愈合率,评价创面愈合速度。之后,对各组已行创面大体观察及记录的小鼠行麻醉处理并处死,获取组织通过HE染色进行组织学观察并计算组织学评分,评价创面愈合质量。对实验数据分析采用析因设计方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。实验结果:1.HOTAIR在人体烧伤组织中表达水平为（29.28±2.07）显著高于在正常皮肤组织中的表达水平（1.11±0.11）（P<0.05）,比后者上调近30倍。2.细胞主要呈现集群式分布,集群形态大且圆,集群内细胞的胞质较少、胞核较大且类圆形;上述表现符合表皮干细胞形态学特征。3.细胞表面CD44表达呈强阳性、表达率高达（95.1±2.06）%;CD45、CD34和CD14呈阴性表达,表达率分别为（0.22±0.03）%、（0.17±0.05）%、（0.18±0.06）%（图3）;细胞鉴定为表皮干细胞。4.MTT检测结果显示:培养24、48、72、96 h,pc-HOTAIR组细胞吸光度值显著高于pc-vector组和con-ESCs组（P<0.05）;sh-HOTAIR组细胞吸光度值显著低于sh-NC组和con-ESCs组（P<0.05）;且pc-vector组、sh-NC组和con-ESCs组细胞吸光度值之间差异无统计学意义（P>0.05）。5.BrdU掺入实验结果示:培养10 d,pc-HOTAIR组BrdU阳性细胞率为（64.18±1.42）%,显著高于pc-vector组和con-ESCs组（（45.82±2.74）%、（46.60±2.46）%）（P<0.05）,sh-HOTAIR组BrdU阳性细胞率为（22.75±1.41）%,显著低于sh-NC组和con-ESCs组（（44.13±4.09）%、（46.60±2.46）%）)（P<0.05）。6.CK10 mRNA结果示:培养24,各组间CK10表达不明显差异（P>0.05）。培养48、72、96 h,pc-HOTAIR组CK10表达显著低于pc-vector组和con-ESCs组（P<0.05）;sh-HOTAIR组CK10表达显著高于sh-NC组和con-ESCs组（P<0.05）;且pc-vector组、sh-NC组和con-ESCs组细胞中CK10表达水平之间差异无统计学意义（P>0.05）。7.NANOG mRNA结果示:培养10 d,pc-HOTAIR组NANOG mRNA表达量为（3.53±0.07）,显著高于pc-vector组和con-ESCs组（（1.22±0.05）、（1.41±0.03））（P<0.05）,sh-HOTAIR组NANOG mRNA表达量为（0.29±0.03）,显著低于sh-NC组和con-ESCs组（（1.25±0.08）、（1.41±0.03））（P<0.05）;8.HOTAIR在小鼠创面中于伤后0 d低表达,之后逐渐升高;于7 d表达达到最高,随后逐渐下降;伤后0 d的HOTAIR表达水平均低于其余三个时间点的表达水平,差异具有统计学意义。9.注射后0 d,各组小鼠创面大体相近,为类圆形的烧伤创面。注射后3 d,pc-HOTAIR组可见创面周边正常组织轻度收缩,其余三组创面肉眼未见明显变化。注射后7 d,pc-HOTAIR组创面边缘收缩明显,可见明显上皮化现象,新生表皮组织覆盖部分创面;control组创面周边正常组织轻度收缩,极少量新生表皮在创面边缘出现;pc-vector组和con-ESCs组创面情况介于pc-HOTAIR组和control组之间。注射后14 d,pc-HOTAIR组创面接近愈合,尚余极少量创面未愈、未有新生表皮组织覆盖;pc-vector组和con-ESCs组创缘收缩明显,大部分创面已被新生表皮组织覆盖;control组可见创面较前有部分缩小,创缘可见确切的再上皮化现象但尚余大部分创面未愈合。注射后3 d,四组小鼠创面愈合率基本相近（P>0.05）。注射后7、14 d,pc-HOTAIR组创面愈合率分别为（（36.13±1.65）%、（86.77±3.16）%）明显高于其余三组（P<0.05）,pc-vector组和con-ESCs组创面愈合率分别为（（19.90±2.99）%、（54.28±5.12）%）和（（21.89±1.50）%、（51.98±4.32）%）明显高于control组（（10.90±1.15）%、（29.87±2.73）%）（P<0.05）。10.注射后0 d,可见各组小鼠创面大体相近,为损伤累及真皮浅层的深Ⅱ°烧伤创面。注射后3 d,pc-HOTAIR组可见创面基底有肉芽组织,其余三组创面镜下未见明显变化。注射后7 d,pc-HOTAIR组创面基底可见大量表皮细胞,并可见新生表皮组织及毛囊组织等形成;pc-vector组和con-ESCs组创面基底可见菲薄的新生表皮组织及肉芽组织;control组创面基底可见厚薄不一的肉芽组织。注射后14 d,pc-HOTAIR组创面接近愈合,新生表皮组织大体覆盖全部创面;control组创面基底新生表皮组织覆盖少部分创面;pc-vector组和con-ESCs组创面情况介于pc-HOTAIR组和control组之间,新生表皮组织覆盖大部分创面。注射后3 d,四组小鼠该时间点组织学评分基本相近（P>0.05）。注射后7、14 d,pc-HOTAIR组组织学评分分别为（（8.17±0.31）%、（9.67±0.21）%）明显高于其余三组（P<0.05）,pc-vector组和con-ESCs组组织学评分分别为（（6.00±0.37）%、（7±0.36）%）和（（5.83±0.40）%、（7.33±0.42）%）明显高于control组（（3.50±0.22）%、（5.0±0.26）%）（P<0.05）。结论:1.人烧伤组织与正常皮肤组织比较,HOTAIR有明显差异性表达;在创面愈合过程中,HOTAIR表达呈现明显时序性表达特点;说明HOTAIR可能参与创面愈合过程。2.在离体的表皮干细胞中,上调HOTAIR表达可维持表皮干细胞高度增殖能力及多向分化潜能;说明HOTAIR对表皮干细胞具有调控作用。3.在体创面中,证实靶向HOTAIR过表达的表皮干细胞可以促进创面再上皮化,缩短了修复时间。