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蜘蛛牵丝是目前已知的最为坚韧的天然纤维之一.它具有优异的机械特性,其超强的强度和出色的弹性是其它天然和人工材料所无法比拟的.它的强度非常高,同等重量的蜘蛛牵丝强度是钢的五倍.蜘蛛牵丝优异的机械特性使它在军工、医疗、建材和纺织等行业具有广阔的应用前景.该研究侧重于获得便于操作且高效表达的蜘蛛牵丝蛋白基因结构,继而开展大规模生产拟蜘蛛牵丝蛋白.依据已报道的蜘蛛牵丝蛋白部分cDNA序列,设计合成了两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体,大小分别为360bp和390bp.多聚化分别得到2聚体、4聚体、6聚体、8聚体和16聚体.依据已报道的蜘蛛牵丝蛋白序列设计合成一段大小为19个氨基酸的短肽.将此短肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大耳白兔,获得抗蜘蛛牵丝蛋白血清.将得到的两种结构8聚体和16聚体与表达载体pET-30a连接,获得四种表达载体pET30a-X8、pET30a-X16、pET30a-F8和pET30a-F16.转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.用制备的抗蜘蛛牵丝蛋白血清做Westernblot检测到有蜘蛛牵丝蛋白的表达.表达产物呈梯度排列,主带分别在85KD、165KD、85KD和165KD,与预计大小基本一致.表达量分别为800mg/L、500mg/L、200mg/L和200mg/L左右.根据山羊β-酪蛋白信号肽我们设计了一段长125bp的DNA序列.将此DNA序列分别与两种拟蜘蛛牵丝蛋白基因结构4聚体和6聚体连接后,插入乳腺特异表达载体pBC1,最后得到四种乳腺表达载体pBC1-F4,pBC1-X4,pBC1-F6和pBC1-X6.将pBC1-F4和pBC1-X6两种表达载体用显微注射法生产转基因小鼠.对于pBC1-X6,共获得58只小鼠,用PCR和Southern杂交的方法检测出10只为转基因阳性小鼠,包括5只母鼠和5只公鼠,转基因阳性率约为17﹪.经PCR检测,大部分原代鼠的F1代都可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白基因阳性小鼠.经Western blot检测,在5只阳性原代母鼠和8只F1母鼠的乳汁中,有2只原代母鼠和7只F1母鼠可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白的表达.除了有预计大小蛋白表达外,还有部分小鼠表达与预计大小不一致的产物.用放免方法检测表达量在11-50mg/L.对于pBC1-F4,共出生59只小鼠,用PCR和Southern杂交的方法检测7只为转基因小鼠,包括3只母鼠和4只公鼠,基因整合率为12﹪.所有原代鼠的F1代都可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白基因阳性小鼠.经Western blot检测,在3阳性原代母鼠和6只F1母鼠的乳汁中,有2只原代母鼠和2只F1母鼠可以检测到拟蜘蛛牵丝蛋白的表达.表达产物与预计大小一致.用放免方法检测表达量在11-22mg/L.在大肠杆菌表达和小鼠乳腺表达的结果表明,人工设计合成的两种蜘蛛牵丝蛋白基因结构完整正确.通过该研究将为进一步开展大规模生产拟蜘蛛牵丝蛋白奠定了基础.