动脉粥样硬化（Atherosclerosis）是冠心病和脑卒中的首要原因。随着工业化的进程，今后人类近一半的死亡原因将与这种大血管病相关。动脉粥样硬化曾被认为是一个缓慢的脂质和纤维素在血管内壁积聚的过程，然而直至最近10年，人们逐渐认识到炎症反应在动脉粥样硬化发生、发展中的重要地位。随着实验技术不断发展，越来越多的证据显示炎症贯穿了动脉粥样硬化发生、发展的整个过程。但是炎症参与冠状动脉粥样硬化的具体机制尚待进一步研究。C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）最初被认为是一种非特异性炎症标志物，其水平的增加可以预测未来发生冠心病的危险，近年来研究表明CRP可能作为一种致病因素参与了冠心病的整个发病过程，然而目前缺乏足够的实验室证据证明CRP是否作为一种直接的致病因素参与动脉粥样硬化形成。有研究显示在人动脉粥样硬化病变处内皮可以检测到CRP蛋白以及mRNA的存在，而正常血管内皮没有发现CRP，说明CRP可能参与动脉粥样硬化部位的内皮系统炎症过程。有人认为CRP可能增加细胞间黏附因子（intercellular adhesionmolecule，ICAM）、血管细胞黏附因子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）、E—选择素（E-selectin）、单核细胞趋化因子—1（monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1）的表达。CRP水平也被证实与血管内皮反应性呈负相关关系，除此以外，CRP还可以促进内皮细胞中内皮素—1（endothelin-1，ET-1）的释放，并诱导黏附因子和趋化因子的上调。人源CRP转基因小鼠与载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因剔除小鼠杂交产生CRPtg^+／0／ApoE^-／-小鼠的研究发现，人源CRP表达可以加速主动脉粥样硬化斑块发展程度。然而，关于上述实验有学者存在不同的看法，认为离体实验的相关结果可能与CRP的制备过程中的一些副产品有关，而非CRP的作用。有人认为人源CRP转基因小鼠的动脉粥样硬化形成也不是CRP的直接作用。尽管越来越多的证据显示CRP对于动脉粥样硬化形成并非是一个旁观者，但是目前没有充分证据可以说明CRP具有独立诱导动脉粥样硬化斑块形成的能力。目前，相当多研究仅仅把CRP作为一种普通血浆蛋白来讨论其能否诱导内皮系统炎症发生，忽视了CRP的特殊结构和其重要的生理功能，而如果探讨CRP在动脉粥样硬化中形成起保护性作用还是破坏性的作用，就有必要充分考虑CRP的结构和生理功能。CRP是一种五聚体蛋白（pentraxins），外径为102 A，由5个相同的单体以非共价键结合，形成双面的环形结构，每个单体的配体识别位点或受体结合位点分别位于五聚体两个平面上，分别组成配体识别相和效应器相，从而构成特殊的二相性结构：一面为配体识别相，含有磷酸胆碱（phosphorycholine，PCh）结合位点，能够使CRP识别在病理条件下暴露出PCh的凋亡细胞、酶修饰低密度脂蛋白（enzyme modified low density lipoprotein，E-LDL）等。E-LDL是天然低密度脂蛋白（native Low density lipoprotein，N-LDL）在多种蛋白酶，如胰蛋白酶、神经氨酸酶、胆固醇酯酶等作用下的代谢产物，其主要特点是结构发生改变（N-LDL大小均匀，平均直径250±30 A，E-LDL大小差异极大，直径为100-2000 A），暴露磷酸胆碱位点，能够被CRP识别；另一面为效应器相，能够与巨噬细胞、单核细胞表面受体FcγRⅡa结合，介导巨噬细胞、单核细胞识别及吞噬凋亡、坏死细胞作用。CRP的效应器相也可以结合Clq，但一般仅在结合配体的条件下具备激活补体的能力。内皮细胞是否具有能力捕获E-LDL／CRP复合体目前尚无实验证实。了解动脉粥样硬化早期形成机制对于研究冠心病发生发展的整个病理生理过程至关重要。脂质的代谢异常是动脉粥样硬化形成的最重要原因之一，这一点已经成为共识，然而对于其中具体的病理生理过程，尤其LDL的氧化修饰、酶降解以及相关产物对动脉粥样硬化形成的意义至今仍是争论的热点。虽然LDL升高是冠心病的危险因素，但是一般认为天然LDL不具有致动脉粥样硬化形成的能力，而是其代谢产物如E-LDL、氧化LDL（Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）等参与了动脉粥样硬化的形成。尽管目前对于ox-LDL参与动脉粥样硬化的研究较多，但是ox-LDL却缺乏触发动脉粥样硬化早期形成的依据。有研究发现在早期动脉粥样硬化斑块部位CRP与E-LDL、补体共同存在，而ox-LDL不在其中，说明E-LDL、CRP、补体的共同参与可能是动脉粥样硬化早期形成的病理基础。CRP、E-LDL以及补体以何种机制在动脉粥样硬化早期病变的血管内膜沉积依然不清楚，现有研究均无法解释CRP、E-LDL及补体在早期血管病变处的沉积问题。因此，动脉粥样硬化早期斑块形成机制值得进一步探讨。炎症、脂质代谢紊乱与动脉粥样硬化三者之间应该存在密不可分的联系，对此深入探讨将会对冠心病的发病机制有更进一步的了解。本课题目的在于探讨CRP在脂质参与的动脉粥样硬化形成中是否起到介质作用，主要通过检测直接CRP能否诱导内皮细胞炎症表现，基因芯片分析CRP对内皮系统的细胞信号转导通路的影响，探讨CRP参与调控内皮系统炎症过程的主要机制，并且通过一步法密度梯度离心分离LDL，复合酶处理生成E-LDL，直接荧光标记CRP和LDL，分析CRP介导脂质紊乱尤其是LDL代谢产物参与动脉粥样硬化早期形成的作用。全文共分三部分：第一章CRP诱导内皮细胞炎症相关因子的表达：目的：通过CRP直接处理内皮细胞诱导炎症相关蛋白及mRNA的改变，探讨不同浓度的CRP对内皮细胞是否具有直接的致炎作用。方法：分别通过细胞ELISA法检测空白对照组，1 mg／L CRP组、5 mg／L CRP组、CRP 20mg／L组对内皮细胞诱导ICAM-1、以及可诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase iNOS）在人脐静脉内皮细胞的表达；RT-PCR法检测空白对照组，1mg／L、5mg／L、10mg／L及20mg／LCRP诱导内皮细胞ICAM-1mRNA表达的变化。结果：对于ICAM-1的诱导与对照组没有显著差异（P＞0.05），而CRP 20mg／L组较其它组对ICAM-1有显著的增加（P＜0.01）。空白对照组，1mg／L CRP组与5mg／L CRP组对于iNOS的诱导与对照组没有显著差异（P＞0.05），而CRP 20mg／L组较其它组对iNOS有显著的增加（P＜0.01）。同样，RT-PCR结果显示只有20 mg／LCRP可以明显提高ICAM-1 mRNA的表达。结论：虽然目前有研究认为高水平CRP可以诱导炎症相关蛋白在内皮细胞的表达，但是本研究通过细胞ELISA法及RT-PCR法检测CRP对内皮细胞诱导炎症相关蛋白及其mRNA表达后认为，CRP在正常生理水平对内皮细胞的炎症相关蛋白及mRNA表达影响不大，仅在较高浓度情况下才可能对内皮细胞诱导炎症相关因子表达产生影响，因此如何解释CRP在0～10 mg／L的正常生理水平条件下参与动脉粥样硬化形成的过程，以及是否有其他因素参与值得进一步探讨。第二章CRP致内皮细胞炎症相关细胞信号转导通路筛选目的：本研究通过特异性和敏感性较高的低通量信号转导通路基因芯片，探讨高浓度的CRP处理对内皮细胞信号转导通路的影响。方法：设CRP处理组以及对照组，分别给予20 mg／L CRP或磷酸盐缓冲液（PBS）与培养的人脐静脉内皮细胞进行处理24 h，然后提取RNA进行基因芯片检测，采用的基因芯片共包含18个信号转导通路：促有丝分裂通路、Wnt通路、Hedgehog通路、TGF-β通路、Survival通路、p53通路、应激通路、NF-κB通路、NFAT通路、CREB通路、Jak-Stat通路、雌激素通路、雄激素通路、钙与蛋白激酶C通路、磷脂酸C通路、胰岛素通路、低密度脂蛋白通路、维甲酸通路。结果：CRP处理组较对照组分别有13种基因表达增加、25种基因表达降低。CRP处理组信号通路增加最显著的是WISP家族的表达增强，尤其WISP2，达到37.63倍；诱导凋亡关键信号通路p53相关基因表达增加30.5倍，而抑制凋亡相关信号通路Bcl-x相关基因表达降低10.41倍。结论：以往针对CRP诱导内皮细胞信号转导通路激活主要集中NF-κB通路和MAPKs系统，本研究通过基因芯片对参与信号转导的18条主要通路进行筛选，结果发现CRP对于传统认为可以激活例如ICAM、VCAM、iNOS等炎症相关的信号通路在本研究均没有显著改变或低水平改变，而对于WISP及凋亡相关信号通路有较明显的改变。目前认为WISP家族是一族与细胞增殖相关生长因子，在某些炎症条件下例如类风湿关节炎被激活，参与炎症过程，尤其是WISP2在慢性炎症的发生发展中起相当关键的作用，本实验证实CRP有可能是WISP2激活的直接因素，从而可能进一步调控内皮系统炎症的发生。本研究同时发现p53信号显著增强，达到对照组30.50倍，而bcl-x和bcl-2相关基因则分别下调10.4倍和2.01倍。其中p53是调节细胞周期和介导细胞凋亡最关键的信号通路之一，参与调控超过60种基因表达，而后两者则是抑制细胞凋亡最关键的信号通路。因此得出结论，高于正常生理水平的CRP可能确实参与内皮系统的炎症发生，其机制可能是通过诱导细胞凋亡及激活细胞增殖相关蛋白信号通路的表达。第三章CRP介导E-LDL诱导内皮细胞损伤的研究目的：通过分析CRP的特殊结构和功能，结合LDL研究，探讨CRP在动脉粥样硬化形成中可能具有的中间介质作用。方法：本研究参考文献改进LDL提取方法，通过一次性密度梯度超速离心，分离LDL，并且通过复合酶处理以及铜离子氧化法分别生成E-LDL和ox-LDL，并直接对CRP及LDL进行荧光标记，通过与内皮细胞共孵育，利用荧光显微镜检测CRP及LDL与内皮细胞结合，实验分为8组：空白对照组、CRP组、N-LDL组、ox-LDL组、E-LDL组、CRP+N-LDL组、CRP+ox-LDL组、CRP+E-LDL组。结果：1)通过超速密度梯度离心一次性提取LDL和LPDS，改进了过去提取LDL需要2次超速离心，每次需要离心24-48小时的方法；2)FITC可以直接对CRP进行标记，不干扰CRP的受体和配体结合位点，对CRP的生理功能没有明显的影响；3)N-LDL和E-LDL不能够被内皮细胞识别，ox-LDL对内皮细胞有微弱的结合能力；4)在CRP共孵育条件下，天然LDL和ox-LDL不能够联结内皮细胞，而E-LDL可以高亲和力与CRP结合，从而形成CRP／E-LDL复合体与内皮细胞结合。结论：CRP是一种双面五聚体结构，每个单体的配体识别位点或受体结合位点分别位于五聚体两个平面上，分别组成配体识别相和效应器相，从而构成特殊的二相性结构。由于CRP的识别相可以结合被暴露出磷酸胆碱结构的E-LDL，形成E-LDL／CRP复合体，而内皮细胞表面能以高亲和力识别CRP的配体相，从而CRP-相性结构具有结合E-LDL，被内皮细胞捕获，引起脂质沉积和激活补体、触发炎症反应的可能性，这样可以解释早期动脉粥样硬化为何同时存在E-LDL、CRP、补体，而这三种物质在同时、同地出现绝非一个巧合。由此得出结论，CRP是一种保守蛋白，在正常生理水平主要参与坏死、凋亡细胞的清除，但是在脂质代谢紊乱的情况下，能够介导异常脂质尤其是E-LDL参与动脉粥样硬化的形成。总结：1)CRP是一种保守蛋白，在正常生理水平下对内皮细胞没有明显的诱导炎症发生的作用，仅在高浓度条件下有可能诱导细胞炎症相关蛋白及mRNA的表达；2)高于生理水平的CRP对内皮细胞的致炎作用主要通过诱导细胞凋亡及激活细胞增殖相关蛋白信号通路的表达；3)CRP是一种双面五聚体蛋白，结构具有特殊的二相性，能够分别结合内皮细胞和E-LDL。因此，正常生理水平的CRP不能诱导内皮细胞的炎症损伤，但是在有脂质代谢紊乱的条件下，能够介导E-LDL参与内皮损伤，补体激活，从而触发动脉粥样硬化早期形成的过程。