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目的:细胞衰老是一种复杂的应激反应,是导致细胞生长停滞的一种不可逆状态,主要发生在细胞受到不同压力时,可以由多种不同因素（如复制应激、DNA损伤、氧化应激、癌基因诱导、化学疗法、线粒体功能障碍、表观遗传和旁分泌）所触发。恶性肿瘤是一种年龄相关疾病,是老年人主要的死亡原因之一。细胞衰老可以发生在不同的生理和病理过程中,在癌症治疗中,诱导细胞衰老是肿瘤发生发展的有效屏障,是重要的抑癌机制之一。随着抑癌机制研究的不断深入,通过诱导肿瘤细胞衰老来阻止肿瘤发展正逐渐受到重视,诱导肿瘤细胞衰老的具体生物学过程也越来越受到关注。长链非编码RNA（lncRNAs）通过在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达,在广泛的生物学过程中发挥着核心调节因子的作用。对lncRNAs重叠蛋白编码基因启动子区域的研究发现,许多lncRNAs都与细胞周期调控相关,这暗示了lncRNAs在不同生物学过程中以及在细胞命运最终决定过程中的潜在作用。近年来,十余种lncRNAs被发现与细胞衰老相关。有研究表明,lnc MEG3可以通过影响内皮细胞功能进而在调控血管内皮细胞衰老方面发挥重要的作用,所以深入探讨lnc MEG3在肿瘤细胞衰老过程中的作用机制,可能有助于揭示肿瘤细胞衰老与抑癌机制相互联系的分子基础,为诱导肿瘤细胞过程中lnc MEG3成为肿瘤治疗的新方向奠定基础。本课题组前期实验已经证实,在肿瘤细胞衰老过程中YAP出核增加,其表达受到抑制会导致细胞增殖能力下降。VGLL4是包含TDU结构域的VGLL家族转录辅因子（VGLL1-4）的成员,在多种肿瘤细胞中起到强大的抑癌作用,目前已有文献报道了在细胞增殖过程中,VGLL4作为一个共转录因子可以与YAP竞争性结合下游的转录因子。Lnc RNAs可以通过与miRNAs,m RNAs和蛋白质的相互作用在基因表达的表观遗传调控中起关键作用,而miRNAs也可以直接或间接地影响lncRNAs的表达水平。许多文献已经报道了lncRNAs通过发挥分子海绵的作用影响下游miRNAs的表达水平。越来越多的证据表明,lncRNA/micro RNA/m RNA调控轴参与了多种细胞生物学过程。鉴于诱导肿瘤细胞衰老的转录及转录后调控在基因表达中的重要作用,本实验旨在前期工作基础上明确lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴在依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老过程中的生物学作用,并进一步探索诱导肿瘤细胞衰老对于癌症治疗的重要意义。研究方法:1、体外培养肺腺癌A549细胞系及乳腺癌MCF-7细胞系,利用依托泊苷诱导并构建上述两种肿瘤细胞的衰老模型;2、利用SA-β-Gal染色验证上述建立的A549及MCF-7细胞模型的衰老程度;3、利用Western Blot检测细胞衰老过程中,衰老相关基因的表达变化,利用qRT-PCR检测衰老相关基因及衰老相关分泌表型基因的m RNA表达变化;4、利用流式细胞仪检测并验证依托泊苷诱导的A549及MCF-7细胞衰老模型的细胞周期阻滞情况;5、利用生物信息学分析并筛选依托泊苷诱导A549细胞衰老过程中的差异基因;6、利用qRT-PCR检测lnc MEG3的表达水平并检测lnc MEG3高或低表达对肿瘤细胞衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;7、利用免疫荧光法检测衰老过程中VGLL4的核定位情况;分离并提取细胞核、浆蛋白,利用Western Blot检测VGLL4在细胞胞浆及胞核中的表达情况;8、利用生物信息学方法预测lnc MEG3及VGLL4的靶micro RNA,利用双荧光素酶报告检测目的基因与靶micro RNA的结合情况;9、利用qRT-PCR及Western Blot检测miR-16-5p的表达水平并检测miR-16-5p高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;10、利用qRT-PCR检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因m RNA表达水平的影响;11、利用Western Blot检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响;12、利用SA-β-Gal染色及Western Blot检测lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4调控轴的功能:对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响。结果:1、低剂量依托泊苷可以诱导A549及MCF-7细胞衰老;2、LncMEG3在A549及MCF-7细胞衰老模型中表达升高;3、低表达lnc MEG3显著抑制A549及MCF-7细胞衰老,高表达lnc MEG3在一定程度上促进A549及MCF-7细胞衰老;4、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,共转录因子VGLL4与YAP形成竞争性抑制,VGLL4在细胞核内表达增加,在细胞内总表达水平上调;5、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,lnc MEG3通过直接相互作用抑制miR-16-5p的表达;6、Mi R-16-5p参与了A549及MCF-7细胞的衰老过程;7、VGLL4在A549及MCF-7细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因;8、VGLL4参与了A549及MCF-7细胞衰老过程的调控;9、在A549及MCF-7细胞衰老过程中VGLL4的表达受lnc MEG3的调控;10、在A549及MCF-7细胞衰老过程中,lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴发挥了调控作用。结论:1、在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3通过海绵效应与miR-16-5p结合并抑制miR-16-5p表达,进而解除miR-16-5p对VGLL4表达的抑制作用,最终影响肿瘤细胞衰老过程;2、肿瘤细胞衰老过程中VGLL4表达水平上调且受lnc MEG3的调控;3、肿瘤细胞衰老过程中存在VGLL4的细胞内异位。