论文部分内容阅读
类黄酮(Flavonoids)是柑橘果实中抗氧化活性成分的重要来源之一,研究其代谢机制及其合成途径中关键酶基因的表达模式对柑橘类黄酮的开发和利用至关重要。本文以红肉脐橙(Citrus sinensis cv.Cara cara)和‘国庆四号’温州蜜柑(Citrusreticulata Blanco cv.Guoqing NO.4)为试材,克隆类黄酮合成途径中的两个关键酶基因——查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI),应用real-time PCR技术检测其在果实成熟过程中及不同器官和组织中的相对表达量,结合总黄酮含量及主要类黄酮组分的变化,探讨了CHS和CHI基因的表达模式及其对类黄酮积累的调控机制。主要研究结果如下:1、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中总黄酮及三种主要类黄酮组分含量的变化规律。无论是总黄酮还是反式查尔酮、橙皮苷和柚皮素-7-β-芸香糖苷,它们在两品种果皮中的含量均远高于其在同时期果肉中的含量。随着果实的成熟,总黄酮在两品种果皮中的含量均逐渐下降,而在果肉中变幅较小且差异不显著(P＜0.05)。三种类黄酮组分在红肉脐橙果皮和果肉中的含量变化基本一致,均呈双峰变化趋势,即三者含量均先逐渐上升至转色期(11月5日)前后达到其峰值而后逐渐下降,最后又有所升高。随着果实的成熟,三种类黄酮组分在‘国庆四号’温州蜜柑果皮和果肉中的含量均基本呈下降趋势,但在果肉完全成熟时(10月30日)又均有所升高,而果皮中橙皮苷和柚皮素-7-β-芸香糖苷的含量在转色之后的10月20日前后都有一个先显著下降、然后显著升高、再下降的过程(P＜0.05)。2、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)基因克隆及其序列分析。克隆的CHS和CHI基因碱基序列长度分别为1425 bp和731 bp,在GenBank中的登录号分别为FJ887897和FJ887898。序列分析结果显示,其开放读码框(ORF)分别为1176 bp(64～1239 bp,编码392个氨基酸)和669 bp(16～684 bp,编码223个氨基酸)。3、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中CHS和CHI基因的相对表达量。CHS和CHI基因在红肉脐橙果皮中均基本呈下调表达趋势,但CHI基因的下调幅度较大;在果肉中均是转色期(11月5日)之后下调表达,之前略有下降但变化不显著(P＜0.05)。两基因在‘国庆四号’温州蜜柑果皮中也均为下调表达,但CHS基因的下调幅度较大;两者在果肉中均基本呈上调表达趋势,但表达量起伏波动较大。4、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑不同器官和组织中的总黄酮含量及CHS和CHI基因的相对表达量。两品种总黄酮含量均是叶中最高、茎次之,根中含量最低,仅分别为其叶中总黄酮含量的7.0%和5.3%。CHS和CHI基因表达在两品种间的差异较大,两基因在红肉脐橙中均是叶中的相对表达量最低,分别为0.02和0.06(均以根中表达量为参照值),其中CHS基因在幼果果肉中的表达量最高(5.52)、茎次之(3.12),CHI基因则是根中最高(1.0)、茎次之(0.65)。两基因在‘国庆四号’温州蜜柑中的相对表达量则均是叶中最高(分别为7.86和2.39)、茎次之(分别为7.81和1.44),CHS和CHI基因在根(1.0)和幼果果肉(0.10)中的相对表达量最低。5、CHS和CHI基因表达对类黄酮积累的调控机制。两品种果实成熟过程中,CHS与CHI基因表达高度相关,其相关系数在红肉脐橙中分别为0.90(果皮中)和0.96(果肉中),在‘国庆四号’温州蜜柑中分别为0.98(果皮中)和0.85(果肉中)。CHS、CHI基因表达与总黄酮含量也高度相关,在红肉脐橙果皮中分别为0.89(CHS)和0.81(CHI),在‘国庆四号’温州蜜柑果皮中分别为0.89(CHS)和0.95(CHI)。此外,两基因表达与‘国庆四号’温州蜜柑果皮中反式查尔酮含量变化的相关系数分别达到了0.94(CHS)和0.99(CHI),与另外两种类黄酮组分的相关性也均较高(r=0.62～0.78)。由此表明,CHS和CHI基因共同构成了柑橘类黄酮合成途径中的限速酶,直接参与类黄酮积累的调控,但由于柑橘果实中其它物质的成分也比较复杂(如糖、酸、类胡萝卜素等),两基因对其类黄酮积累的调控机制还不甚明朗。