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目的:建立简便、快速、特异的实时定量PCR快速检测鉴定技术,用于鼠疫耶尔森氏菌和炭疽芽孢杆菌快速鉴定与定量检测。 方法:利用SYBR Green Ⅰ随机掺入法的实时定量PCR技术,建立、优化实时定量PCR快速检测反应体系,针对特异的染色体标识序列设计引物,检测鼠疫耶尔森氏菌;针对位于两个毒力相关质粒上的荚膜因子和水肿因子基因设计引物,检测炭疽芽孢杆菌。试验评价了方法的特异性、灵敏度,以盲测试验进行了验证;考核了方法的重复性;检测了模拟污染的土壤和脏器标本,试验中分别根据各菌序列设计内部对照引物,构建相应内对照以消除假阴性的干扰。结果:(1) 建立了实时定量PCR快速检测鉴定鼠疫耶尔森氏菌的反应体系及条件,对我国18个生态型共计275株鼠疫耶尔森氏菌的检测结果均出现特异扩增峰,而相关32株非鼠疫耶尔森氏菌均呈阴性,定性盲测试验结果显示100%判断准确,两次定量盲测试验Cp值与浓度的相关系数分别为0.979、0.985,检测灵敏度为1.6 CFU/反应体系,肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度为4000 CFU/反应体系;(2) 建立了实时定量PCR快速检测鉴定炭疽芽孢杆菌的反应体系及条件,检测14株炭疽芽孢杆菌均出现特异的扩增结果,而29株非炭疽芽孢杆菌的扩增均为阴性;定性盲测试验结果显示100%判断准确,两个克隆质粒的定量盲测试验的Cp值与浓度的相关系数分别为0.994、0.990,检测炭疽杆菌基因组DNA的灵敏度可达每反应体系0.53pg;两个克隆株提取质粒的检测限分别为每反应体系12拷贝和140拷贝,土壤模拟污染标本检测灵敏度可达36个芽孢/反应体系。 结论:该方法应用于鼠疫耶尔森氏菌和炭疽芽孢杆菌的检测鉴定简便、快捷,具有良好的特异性和敏感性,内对照的设置避免了环境或临床实际样品处理不当所造成的假阴性结果,为防范生物恐怖袭击、应对紧急疫情的发生、动态的疫源地疫情监测提供了快速检测鉴定的有力手段。