论文内容主要分为三个部分，第一部分侧重于甲壳素脱乙酰酶(CDA)产生菌的筛选。 本文比较了几种霉菌：总状毛霉(Mucor racemosus)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)菌株在对数生长末期和稳定期末期的细胞内和细胞外CDA的酶活性。结果显示：(1)各霉菌的胞内和胞外都具有CDA活力，而且胞外的酶活力均大于胞内的酶活力；(2)处于对数生长期末期的总状毛霉菌株的CDA活力最高，其胞外酶活力达到97.2±4.2 U·(g干菌丝体)<-1>，发酵菌株产酶总活力为83.1±3.6 U，均显著高于其他菌株(P<0.5)。酶学特性研究表明：该酶的最适温度为50℃，最适pH在7.2左右，低温保存(4℃)稳定性较差，每24小时酶活力下降30％以上。 第二部分着重从总状毛霉中克隆CDA基因，并对其序列进行分析。 从处于对数生长期的总状毛霉菌丝体中抽提得到总RNA，用已知真菌CDA保守区设计简并引物，进行PT-PCR扩增，结合RACE技术，分离和克隆到了2个总状毛霉CDA的全长cDNA，并进行了全序列测定，提交GenBank，CDAl和CDA2的cDNA序列登录号分别为DQ538514、DQ678929。再根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物，以总状毛霉全基因组DNA为模板，扩增得到了2个CDA基因的DNA片段，克隆并测序。CDA1和CDA2的DNA序列在Genbank的登录号为EF468348、EF468349。利用生物信息学的方法，对总状毛霉的CDA1和CDA2的DNA及cDNA序列进行分析和酶蛋白构象预测，结果如下： (1)CDA1基因(cDNA)全长为1506 bp，包括下列三部分：5’非翻译区(67 bp)；阅读框(1344 bp)，共编码448个氨基酸残基； 3’非翻译区(95bp)，其中包含加尾信号AATAAA及Poly(A)。在该基因的DNA分子内部(876～937bp)有一个内含子，长度为62bp，此内含子的5’和3’剪接位点符合GU—AG规则。 而CDA2基因(cDNA)全长为1378 bp，分别为：5’非翻译区(23 bp)；1254bp阅读框，编码418个氨基酸残基；101bp 3’非翻译区，其中包含了加尾信号AATAAA及Poly(A)。该基因的DNA分子中不含有内含子序列。 (2)通过同源性搜索(Blastp)可知：CDA1和CDA2的cDNA中间部分均包含一由144个氨基酸残基组成的多糖脱乙酰酶保守结构域，约占总状毛霉CDA全长的30％。该保守结构域不仅存在于毛霉属(Mucoraceae)微生物的CDA中，而且在其他真菌(如Saccharomyces cerevisiae)中存在，甚至在一些细菌(如Bacillus subtilis)的多糖脱乙(3)CDA1基因与其它相近种米根霉(Rhizopus oryzae)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2基因的序列同源性分别为：75％、58％、56％、56％、48％、39％、39％、17％和16％；相应的氨基酸序列的同源性分别为：69％、57％、59％、55％、47％、30％、32％、18％和21％。CDA2基因与该霉的CDA1基因、其它相近种米根霉、卷柄根霉的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉、卵形孢球托霉、匍枝根霉、布拉克须霉、酿酒酵母的CDA1和CDA2基因的序列同源性分别为：55％、51％、55％、53％、68％、43％、35％、15％、 14％和H13％；相应的氨基酸序列的同源性分别为：52％、52％、54％、49％、66％、47％、33％、32％、23％和24％。所以，真菌的CDA基因在进化上并不保守。 (4)根据CDA基因推测所得氨基酸序列构建的不同真菌的系统树，与采用经典分类法构建的系统树基本一致。 (5)通过同源建模方法，预测了CDA1和CDA2基因所编码的蛋白质的三级结构，验证了蛋白质具有CDA完整的功能性结构，并包含多糖脱乙酰酶结构域，两者具有相似的空间结构。 (6)信号肽预测分析表明：CDA1和CDA2推测蛋白质的N-末端均存在信号肽，信号肽长度分别为22和24个氨基酸残基。 第三部分的主要内容为将总状毛霉CDA1和CDA2基因进行原核表达，并对重组蛋白纯化、分析。 运用基因重组的方法手段，将CDA1和CDA2基因构建进入原核表达质粒pET28a、pET22b、pET32a及pET43.1a，经过PCR鉴定、双酶切鉴定以及表达区域全部或部分序列测定，结果证实：已正确构建了pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET32a-CDA1、pET32a-CDA2、pET43.1a-CDA1、pET43.1a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b-CDA2共8个重组质粒。其中pET28a-CDA1、pET28a-CDA2的全序列测定表明：重组区域的CDA1基因(共1278bp)有4个碱基发生突变，两个造成了氨基酸突变；而重组质粒的CDA2基因(共1182bp)中也有2处碱基发生突变，其中之一的氨基酸序列也发生了突变，两基因片段突变率均小于0.5％；在其余6个重组质粒的表达基因接入区域，部分序列测定的结果显示：CDA1和CDA2的基因(无内含子)均已去除信号肽，并正确的接入了表达区域，未产生移码突变。 将8个重组质粒转化进入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，采用37℃、终浓度为0.5～lmmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达。结果表明：重组质粒在宿主细胞内都成功地表达产生了蛋白质，所得的重组蛋白或融合蛋白的分子量与预计的理论值相符。重组质粒pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b-CDA2表达的重组蛋白以包含体为主；而pET32a-CDA1、pET32a-CDA2、pET43.1a-CDA1及pET43.1a-CDA2表达的融合蛋白仍以包含体为主，但已能电泳检测到一定比例的司溶表达部分。利用亲和层析可以分离、纯化重组质粒pET28a-CDA1、DET28a-CDA2表达的包含体蛋白质。从诱导后表达的细胞中离心分离出包含体形式的重组蛋白，用6M盐酸胍变性溶解后，专一性的结合在HisTrap(Ni<2+>-Sepharose)亲和柱，用6-0M脲线性梯度、使变性的重组蛋白在柱上重折叠，最后改变咪唑浓度(10-500mM)、梯度洗脱亲和柱上结合的重组蛋白，得到了单一的洗脱峰，该洗脱峰组分经SDS-PAGE鉴定为电泳纯，分子量与CDA1和CDA2重组蛋白一致。将亲和层析洗脱得到的重组蛋白组分进行脱盐除去咪唑，防止对酶活性测定造成干扰，结果表明：经过亲和层析、凝胶过滤层析所得的CDA1和CDA2重组蛋白溶液，均具有一定的甲壳素脱乙酰酶活性，酶的比活力分别为0.01U/mg和0.05U/mg。