已知HBV感染是肝细胞肝癌的高危因子之一，其中HBV编码的HBx蛋白被认为主要参与了肝细胞肝癌的发病过程。虽然对HBx在肝细胞肝癌中的作用机制的研究已有不少，但其中许多结果相互矛盾。因此，目前关于HBx在肝细胞肝癌发病过程中的确切作用机理依然没有定论。近年的一些研究显示野生型HBx在肝细胞内表现出促进细胞凋亡和抑制细胞转化的作用，而一些分离自肝癌组织的HBx突变体，尤其是C端截短型的HBx突变体，则表现出抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的作用。这些研究结果对肝细胞肝癌发生过程中HBx的作用提出了新的解释，指出了新的方向。然而目前所报道的C端截短型HBx突变体之间突变模式各不相同，突变的原因也不明确，而且没有研究证明在肝细胞肝癌的前期病变——慢性HBV感染的肝组织内也分离到这种C端截短型HBx突变体。因此本研究从检测慢性HBV感染的肝组织和HBV阳性肝癌组织内HBX基因突变入手，通过体外转染研究APOBEC3s引起HBX基因突变模式，探讨C端截短型HBx突变体产生的机制。进而体外检测C端截短型HBx对细胞增殖的影响，探讨其在肝细胞肝癌发病机理中的作用。第一部分：慢性HBV感染者肝组织和HBV阳性肝细胞肝癌组织内HBX基因突变模式研究目的：本研究第一部分首先检测慢性HBV感染患者肝组织内和HBV阳性的肝细胞肝癌病人癌组织标本内HBX基因的突变情况，并对两种标本内HBX基因突变模式的特点进行分析，对比两种HBX基因突变模式之间是否存在相关性，尤其是是否存在与已报道的HBx突变类型相似的C端截短型HBx突变体。在两种组织标本内是否存在相同的C端截短型HBx突变体。方法：收集慢性HBV感染者肝穿组织标本和HBV阳性的肝细胞肝癌组织标本，提取DNA。通过3D-PCR方法扩增HBX基因，将HBX基因扩增产物克隆到克隆载体内，挑取并扩增单克隆质粒，回收质粒后通过DNA测序的方法来检测HBX基因的突变。通过DNA序列对比软件将所测得的HBX基因序列进行多序列对比分析，分析两种组织标本内HBX基因的突变模式，以及突变对HBx蛋白序列的影响。对比两种组织标本内HBX基因及其编码的HBx蛋白突变模式是否一致。结果：在所检测的7例慢性HBV感染者肝穿标本内，有3例标本内检测到HBX基因存在G→A超突变。而且有部分HBX基因内发生在第359位和第360位鸟苷酸的G→A突变导致色氨酸密码子TGG突变终止密码子TAA，这种突变导致HBX基因提前终止产生C端截短型的HBx突变体蛋白。在所检测的2例HBV阳性的肝细胞肝癌组织内，所扩增的HBX基因内也检测到与慢性HBV感染者肝穿标本内相似的G→A超突变和C端截短型HBx突变体存在。本研究所发现的C端截短型HBx突变体在现有的研究中未见报道，该突变体在某些慢性HBV感染者肝穿组织内和HBV阳性肝细胞肝癌组织内同时存在，提示可能与HBV相关的肝细胞肝癌有关。虽然有研究报道慢性HBV感染过程中HBV基因的突变可能来源于逆转录酶出错或HBV基因组与宿主细胞基因组的重组。但最近的研究证实胞嘧啶脱氨酶APOBEC3s家族能够在HBV由前基因组RNA逆转录为基因组DNA的过程中编辑新合成的单链cDNA使之产生G→A超突变，提示APOBEC3s家族很可能是HBV基因组发生突变的主要原因。然而APOBEC3s编辑HBV基因组产生的突变在HBV基因组内不同部位之间是否存在差异，突变对于HBV相关蛋白尤其是HBx蛋白会产生怎样的影响现在还不清楚。第二部分：胞嘧啶脱氨酶APOBEC3s编辑产生的C端截短型HBx突变体在肝细胞肝癌发病机制中的作用目的：检测APOBEC3s家族编辑HBV基因组产生突变的特点，尤其是HBX基因突变的模式与慢性HBV感染者和HBV阳性的肝细胞肝癌组织内的HBX基因突变是否存在相关性，是否会产生相似的C端截短型HBx突变体。进而探讨APOBEC3s编辑产生的HBx突变体在肝细胞肝癌发病机制中的作用。方法：通过体外共转染实验检测APOBEC3s家族对HBV基因组的突变作用，分析APOBEC3s所引起的突变在HBV基因组内不同区域之间的分布特点。分析APOBEC3s所引起的突变的特点，尤其是HBX基因的突变模式，并与慢性HBV感染者和HBV阳性的肝细胞肝癌组织内的HBX基因突变模式进行对比，试图解释体内HBX基因突变的原因。同时根据HBV感染时参与体液免疫的分子及用于HBV感染治疗的药物，选择干扰素作为诱导剂，研究APOBEC3s家族在肝细胞内的表达调控，进而揭示HBV感染过程中APOBEC3s家族编辑HBV基因组的病理生理学机理。通过体外转染实验研究所发现的C端截短型HBx突变体对细胞增殖的影响，进而研究其分子机制，探讨其在肝细胞肝癌发生过程中的作用。结果：体外APOBEC3s和HBV共转染实验发现A3B、A3C、A3F和A3G在细胞内都可以编辑HBV基因组产生G→A超突变，其突变的热点区域在HBX基因。进一步的研究发现干扰素可以诱导肝癌细胞系和原代肝细胞内APOBEC3s家族的表达。而且在这些APOBEC3s家族编辑产生的HBX基因突变中也存在与慢性HBV感染者肝穿组织和HBV阳性肝细胞肝癌组织内相同位置终止的C端截短型HBx突变体。体外研究这种C端截短型HBx突变体的生物学功能发现，与野生型HBx促进细胞凋亡抑制细胞增殖不同，C端截短型HBx突变体具有通过影响细胞周期相关蛋白的表达而促进细胞增殖的功能。提示这种APOBEC3s编辑产生的C端截短型HBx突变体可能参与了肝细胞肝癌的发病过程。肿瘤的发病机制中某些重要基因的突变被认为是原因之一，虽然目前关于肿瘤中基因突变的研究很多，但多数基因突变的原因仍然不明。由于APBOEC3s家族具有编辑单链DNA产生基因突变的功能，该家族成员能否引起细胞基因组DNA产生突变也成为许多学者关心的问题。虽然目前只有A3B和A3C在细菌内引起基因组产生突变的报道，但相关的研究仍然是大家关注的热点。A3B不同于其他已知的能诱导产生突变的APOBEC3s家族成员，该蛋白被证明主要分布于细胞核内，而且在正常非增殖组织中表达水平普遍很低，而在某些肿瘤细胞内表达较高。提示A3B的高表达有可能参与了某些肿瘤的发生过程。但目前有关A3B在肝细胞肝癌内的表达情况还未见报道。第三部分：APOBEC3B异常表达与肝细胞肝癌的关系目的：检测A3B在肝细胞肝癌及其配对癌旁组织内的表达特点，A3B在肝癌细胞内表达对细胞增殖的影响。进而探讨A3B与肝细胞肝癌的关系。方法：通过检测A3B在肝细胞肝癌和配对癌旁组织内的表达情况，并与其他APOBEC3s家族进行比较。通过免疫荧光技术和EGFP融合蛋白表达方法检测A3B在肝癌细胞内的分布。通过体外转染实验检测A3B高表达对肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响。通过人肿瘤信号通路相关基因芯片方法检测A3B高表达对人肿瘤信号通路相关基因表达的影响。进而探讨A3B高表达在肝细胞肝癌发病中的作用。结果：与其他APOBEC3s家族成员不同，A3B在肝细胞肝癌组织内的表达普遍高于其在配对癌旁组织内的表达。而且A3B在肝癌细胞内表达时主要分布于细胞核内。体外研究A3B生物学功能发现A3B在细胞内高表达可以促进细胞增殖，其机理可能是调控某些与肿瘤相关的基因表达水平。提示A3B高表达可能与肝细胞肝癌相关。结论：本研究证实在慢性HBV感染过程中参与体液免疫的干扰素可以诱导肝细胞内APOBEC3s家族的表达，被诱导表达的APOBEC3s通过脱氨酶活性编辑HBV基因组使之产生G→A超突变，HBX基因是热点突变区。持续的HBV感染导致APOBEC3s家族被持续诱导表达可以通过编辑HBX基因引起G→A超突变产生一种C端截短型HBx突变体，这种C端截短型HBx突变体具有促进细胞增殖的作用，使表达这种突变体的肝细胞具有克隆增殖的生长优势。而持续的APOBEC3s尤其是A3B的高表达，可以通过调控某些肿瘤相关基因的表达或其他可能的机制而促进肝细胞增殖。因此APOBEC3s编辑的C端截短型HBx突变体及高表达的A3B有可能参与了肝细胞肝癌的发病过程。