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哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)弧菌病的主要病原之一,严重影响了半滑舌鳎工厂化养殖的发展。本论文利用高通量测序技术,对抗病家系和易感家系半滑舌鳎以及哈维氏弧菌胁迫后的抗病家系和易感家系半滑舌鳎进行转录组测序,旨在获得与抗哈维氏弧菌免疫应答过程的免疫基因,为了解半滑舌鳎哈维氏弧菌胁迫下免疫应答的生物学过程提供理论基础,筛选出与抗病性状相关的基因和分子标记,为抗病品系半滑舌鳎的选育提供可靠的资源。(1)使用Illumina HiSeq测序技术对4组半滑舌鳎的12个样品进行测序,获得高质量的双端150 bp测序数据。在12个RNA-seq文库中共获得合计10.95亿条clean reads,使用TopHat2与半滑舌鳎参考基因组比对,71.32%的reads成功比对到基因组上,共注释了23,088个基因,平均长度为2,485 bp。使用Cufflinks和ASprofiling,共获得57,521个可变剪切事件,其中注释的差异可变剪切24个,位于12个基因,并预测了805个新转录本。对转录组数据进一步挖掘,共获得495,195个SNP位点和45,480个InDel位点,其中注释的差异SNP位点42个,注释的差异InDel位点19个。使用HTSeq计算每个样本的基因的FPKM值,并统计了半滑舌鳎12个RNA-seq文库的FPKM的分布情况。(2)为了对不同实验条件下的基因表达水平进行比较,对于同一组半滑舌鳎的重复样本,最终的FPKM为所有重复数据的平均值。我们对4组半滑舌鳎的基因表达水平进行了四组比较:CsRC和CsRU比较,获得了684个上调基因,268个下调基因;CsRC和CsSC比较,获得了108个上调基因,396个下调基因;CsRU和CsSU比较,获得了635个上调基因,408个下调基因;CsSC和CsSU比较,获得了25个上调基因,150个下调基因。GO注释结果显示,CsRC和CsRU比较,6个差异基因(apc2、ccl19、ccl20、il-8、vnt、ercc-6)与免疫应答(immune response)有关;CsRC和CsSC比较,3个差异基因(apc2、dmbt1等)与免疫应答有关;CsRU和CsSU比较,9个差异基因(st3gal4、c1q、tnfα1等),但仅有st3gal4基因在CsRU的表达量高于CsSU;CsSC和CsSU比较,3个差异基因(ccl18、ccl20、c1qtnf9a)与免疫应答有关。KEGG通路富集分析结果显示,多个差异表达基因富集在Jak-STAT信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子与细胞因子受体互相作用等信号通路。CsRC和CsRU比较,筛选出11个免疫相关的差异基因(tlr5、irak4、il-22rα2、lifr、pias1等);CsRC和CsSC比较,筛选出2个免疫相关基因(il-6rα、pias2);CsRU和CsSU比较,筛选出25个免疫相关基因(il-10、epor、gp130、prlr、jak2、stat5b等);CsSC和CsSU的比较,筛选出3个免疫相关基因(socs7、ccl20、tgfβ2)。抗病家系和易感家系半滑舌鳎在感染哈维氏弧菌前后的转录组分析,表明了其在免疫应答中复杂的基因调控网络。另外,通过qPCR验证表明本研究的转录组数据是高质量的、可靠的,符合生物信息学分析要求。(3)LncRNA在表观遗传水平、转录水平、转录后水平上起着十分重要的调控作用。为更深层次了解半滑舌鳎哈维氏弧菌胁迫下免疫应答的调控机制,对RNA-seq数据进行了lncRNA识别和差异表达分析。本实验共获得4,584个lncRNA座位(loci),包含5,714个转录本。LncRNA与编码基因的基本特征比较显示,编码基因的GC含量显著高于lncRNA,编码基因的外显子数目多于lncRNA,编码基因的转录本平均长度小于lncRNA,编码基因的平均表达量略高于lncRNA。通过差异表达分析在四组RNA-seq样本比较中筛选出2,032个差异表达lncRNA。最后,通过qPCR验证了差异表达lncRNA的可靠性。(4)我们从差异表达基因中筛选出了IL-6受体基因,其中IL-6R蛋白包含IL-6Rα和GP130两个部分。为了研究半滑舌鳎il-6rα和gp130基因在哈维氏弧菌胁迫下的表达模式,我们克隆和鉴定了il-6rα和gp130基因的全长和基因结构。组织表达谱结果显示il-6rα和gp130基因均在肝脏中高表达,肌肉中几乎不表达。哈维氏弧菌胁迫后,肝脏、肾脏、脾脏中的il-6rα和gp130基因表达量均呈现显著上调趋势,在肾脏和脾脏中il-6rα和gp130基因的表达模式基本一致,在肝脏中,il-6rα和gp130基因分别在哈维氏弧菌感染后24 h和48 h时表达量达到最大值。此外,还检测了il-6rα和gp130基因在抗病家系和易感家系的肝脏、肾脏、脾脏中的表达差异,结果显示,il-6rα和gp130基因表达量均仅在肝脏中具有显著性表达差异。