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保持基因组的完整性和稳定性对于生物体的存活是至关重要的。DNA双链断裂(DSB)是所有DNA损伤中最为严重的一种,可以通过外界因素(如电离辐射和化学诱变剂)和内源因素(如内源性DNA氧化以及DNA复制压力)产生。哺乳动物体内的DSB修复方式主要有两种:依赖于同源序列的同源重组(HR)和不依赖于同源序列的非同源末端连接(NHEJ)。近几年的研究发现,在经典的非同源末端连接(C-NHEJ)缺失的情况下,DSB末端仍然可以被有效地修复,预示着非经典末端连接(A-EJ)修复通路的存在。A-EJ活性已经在多种系统中得到证实,特别是在C-NHEJ核心因子(如DNA连接酶IV)缺陷的B细胞中,A-EJ介导的IgH基因座位置的抗体类别转换(CSR)效率是野生型细胞的50%。大量研究已经证实A-EJ的显著特点是对微同源序列(MH)的偏好性,以及在染色体转位过程中的重要作用。虽然目前已经有多个蛋白因子被报道参与A-EJ过程,但是其结果往往存在争议,特别是对参与A-EJ修复的DNA连接酶的研究还很不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统,在Lig4缺陷的小鼠B细胞系CH12F3中完全敲除Lig1或者细胞核内的Lig3,建立只含有单个DNA连接酶(分别为Lig3和Lig1)的CH12F3细胞系。令人惊讶的是,只含有Lig1或Lig3的CH12F3细胞仍然具有A-EJ活性,可以有效地催化IgH基因座的CSR过程以及同一条染色体上由CRISPR/Cas9产生的DSB之间的染色体缺失;并且其活性与Lig1/Lig3同时存在的细胞没有明显差别。然而,在催化染色体转位方面,含有Lig1和Lig3的复合物显示出不同的特性。完全敲除细胞核中的Lig3,Lig4-/-细胞的染色体转位明显减少,而在完全敲除Lig1的细胞中则没有这种变化。另外,染色体转位连接处微同源序列的分析揭示了不同DNA连接酶催化活性的特异性。这些数据表明存在多种含DNA连接酶的复合物用以催化A-EJ过程。另外,本研究在小鼠B细胞中建立了 CRISPR/Cas9高通量筛选方法,在野生型和Lig4缺陷的细胞中筛选参与CSR过程中DSB修复的基因。首先建立了 Cas9稳定表达的CH12F3细胞系(野生型和Lig4缺陷型),并对sgRNA筛选的整个过程进行了优化。利用优化的实验条件,在Cas9稳定表达的WT和Lig4-/-CH12F3细胞中进行sgRNA文库的高通量筛选。对不同细胞群中的sgRNA进行高通量测序,通过MAGeCK分析方法,筛选IgA阳性细胞群中显著减少和IgA/IgM双阴性细胞群中显著增加的基因。在WT细胞中,筛选得到了 DNA-PKcs和Lig4等核心C-NHEJ蛋白因子,以及一些已知的参与细胞因子介导的CSR过程的基因。对其它未知功能的候选基因进行检测,发现Brd9和Fbxo28缺失严重影响细胞因子介导的CSR。目前正在对这一结果进行进一步验证。同时,基于Cas9/sgRNA介导的CSR模型的高通量筛选也正在进行。