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前言:宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。2020年,全球有60多万新发病例和超过34万死亡病例,占女性癌症发病率与死亡率第四位。由于有效的一级（HPV疫苗）和二级（筛查）预防措施,宫颈癌被认为是可以预防的癌症,但这些措施在国内外未得到广泛实施,发展中国家宫颈癌的发病率比发达国家高7-10倍,死亡率差距最高可达18倍。因此,研究宫颈癌发生发展的分子机制,寻找早期诊断和治疗的分子靶标,具有重要理论意义和潜在的应用价值。MYCT1（Myc target 1）基因是我们课题组应用电子杂交技术发现的喉癌相关基因,位于染色体6q25,编码235个氨基酸,是MYC基因的直接靶基因,在不同肿瘤的发生中具有组织特异性和调控复杂性,实体肿瘤如喉癌、胃癌和肝癌中,MYCT1低表达,具有抑癌基因功能;血液肿瘤中其作用存在争议,可作为抑癌或癌基因发挥作用。而其在宫颈癌中的相关研究尚未见报道。micro RNA是非编码小RNA,在各物种中广泛存在,通过与靶基因m RNA 3’UTR结合调控靶基因表达,是疾病诊断、治疗和预后判定的重要分子靶标。其中,miR-106b是目前研究的热点。研究表明,miR-106b在多种癌症发生发展中发挥重要作用,可能成为肿瘤诊治的重要分子标志物。miR-106b在宫颈癌中高表达,抑制miR-106b表达可以显著抑制癌细胞迁移和侵袭。HPV癌蛋白可促进miR-106b表达水平,宫颈癌细胞中,敲减HPV E6/E7可抑制miR-106b表达水平。这些结果提示,miR-106b在宫颈癌中具有重要作用,但具体调控机制尚不清楚。通过生物学信息学软件预测,我们发现miR-106b与MYCT1基因表达显著负相关且在MYCT1 3’UTR存在miR-106b结合位点,推测MYCT1可能是miR-106b的潜在靶基因。干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1,IRF-1）基因编码蛋白是转录调节因子,参与人体对病毒和细菌的应答基因转录,在细胞增殖、凋亡、免疫应答和DNA损伤应答中起重要作用。作为肿瘤抑制因子,IRF-1既抑制肿瘤细胞生长,又能刺激针对肿瘤细胞的免疫应答。研究表明,在宫颈癌中HPV16 E6可抑制IRF-1诱导的细胞凋亡,通过抑制P21和P53表达促进细胞生长。HPV16 E7通过将组蛋白去乙酰化酶募集至IRF-1启动子干扰其反式激活能力。通过生物学信息学软件预测,我们还发现miR-106b宿主基因MCM7启动子区存在IRF-1结合位点,提示IRF-1可能通过MCM7的IRF-1结合位点调控miR-106b表达。综上所述,我们推测宫颈鳞癌中可能存在IRF-1/miR-106/MYCT1信号通路,MYCT1可能受该信号通路调控发挥作用。因此,本研究将首先明确MYCT1在宫颈鳞癌中的生物学功能,然后再对其上游调控机制进行深入研究,进一步验证该信号轴在宫颈鳞癌中的生物学作用,这些研究将丰富MYCT1在肿瘤发生发展中的作用机制,为MYCT1相关信号轴作为宫颈鳞癌诊治及预后判断分子靶标的深入研究提供重要依据。材料与方法:1、实验材料:人宫颈鳞癌Caski和Siha细胞系,人宫颈鳞癌及正常宫颈组织标本。2、实验方法:免疫组化、细胞培养、基因瞬时转染、实时定量荧光PCR、Western Blot、CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验、Transwell细胞侵袭实验、染色质免疫沉淀、双荧光素酶报告基因活性检测。结果:1、实时定量荧光PCR结果显示,宫颈鳞癌组织中MYCT1 m RNA表达水平显著低于正常宫颈组织（P<0.001）。免疫组化结果显示,宫颈鳞癌组织中MYCT1蛋白表达水平较正常宫颈组织显著降低（P<0.001）。临床资料统计学分析结果显示,在宫颈鳞癌中MYCT1表达水平与肿瘤直径显著负相关（R=-0.523,P<0.01）,与临床分期显著负相关（R=-0.614,P<0.01）;与宫颈癌远隔转移显著负相关（R=-0.243,P<0.05）。2、CCK-8结果显示,宫颈鳞癌Caski和Siha细胞中,相比对照组,过表达MYCT1细胞增殖能力显著降低（P<0.05）;相反,敲减MYCT1细胞增殖能力显著增高（P<0.05）。Transwell结果显示,相比对照组,过表达MYCT1细胞迁移和侵袭能力显著降低（P<0.05）;相反,敲减MYCT1细胞迁移和侵袭能力显著增高（P<0.05）。3、实时定量荧光PCR和Western Blot结果显示,宫颈鳞癌Caski和Siha细胞中,相比对照组,转染miR-106b mimic后MYCT1 m RNA及蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）;转染miR-106b inhibitor后MYCT1 m RNA及蛋白表达水平均显著增高（P<0.01）。生物信息学预测结果显示,MYCT1 3’UTR区存在miR-106b潜在结合位点,双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,宫颈鳞癌Caski细胞中野生型MYCT1 3’UTR和miR-106b mimic共转染组荧光素酶活性较对照组显著降低（P<0.01）,突变型MYCT1 3’UTR和miR-106b mimic共转染组荧光素酶活性较对照组无显著变化（P>0.05）。4、实时定量荧光PCR和Western Blot结果显示,宫颈鳞癌Caski和Siha细胞中,相比对照组,敲减IRF-1后IRF1 m RNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。生信预测显示,miR-106b的宿主基因MCM7启动子区存在2个相邻的IRF-1潜在结合位点。实时定量荧光PCR结果显示,敲减IRF-1后,宫颈鳞癌Caski和Siha细胞中miR-106b及其宿主基因MCM7表达水平均显著增高（P<0.01）。染色质免疫沉淀及双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,IRF-1能够在体内、体外与MCM7启动子区直接结合。5、实时定量荧光PCR和Western Blot结果显示,敲减IRF-1的宫颈鳞癌Caski和Siha细胞中MYCT1 m RNA和蛋白表达水平均较对照组显著降低（P<0.01）,而共转染si IRF-1和miR-106b inhibitor后MYCT1 m RNA和蛋白表达水平均较敲减组显著升高（P<0.05）,提示IRF-1经miR-106b促进MYCT1的表达。6、CCK-8结果显示,miR-106b inhibitor显著抑制宫颈鳞癌Caski和Siha细胞增殖,敲减MYCT1能够显著回复miR-106b inhibitor对宫颈鳞癌Caski和Siha细胞对增殖能力的影响（P<0.05）。Transwell结果显示,miR-106b inhibitor显著抑制宫颈鳞癌Caski和Siha细胞迁移和侵袭,敲减MYCT1能够显著回复miR-106b inhibitor对宫颈鳞癌Caski和Siha细胞对迁移和侵袭能力的影响（P<0.05）。7、CCK-8结果显示,宫颈鳞癌Caski和Siha细胞中,相比对照组,敲减IRF-1后细胞增殖能力显著增高,miR-106b inhibitor或过表达MYCT1可以分别显著回复敲减IRF-1对细胞增殖能力的影响（P<0.05）。Transwell结果显示,敲减IRF-1的宫颈鳞癌Caski和Siha细胞迁移和侵袭能力显著高于对照组,miR-106b inhibitor或过表达MYCT1能够分别显著回复敲减IRF-1对宫颈鳞癌Caski和Siha细胞迁移和侵袭能力的影响（P<0.01）。8、TCGA数据库分析结果显示,IRF-1和miR-106b表达水平呈显著负相关（R=-0.1342,P<0.05）;miR-106b与MYCT1表达水平呈显著负相关（R=-0.2532,P<0.01）。IRF-1表达水平越低,肿瘤大小、局部浸润、淋巴结转移和远隔转移率越高（P<0.01）;miR-106b表达水平越高,肿瘤大小、局部浸润程度及远隔转移率越高（P<0.01）;MYCT1表达水平越低,肿瘤大小、局部浸润和远隔转移率越高（P<0.01）。结论:1、MYCT1在宫颈鳞癌组织中低表达,通过抑制细胞增殖、迁移及侵袭,发挥抑癌基因作用。2、宫颈鳞癌中存在IRF-1/miR-106b/MYCT1信号通路,其中,miR-106b直接靶向MYCT1 3’UTR区抑制其表达;IRF-1通过直接靶向miR-106b的宿主基因MCM7转录抑制miR-106b表达。3、IRF-1通过miR-106b/MYCT1信号轴抑制宫颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭。