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人促甲状腺素受体(hTSHR)是一种膜蛋白,主要存在于甲状腺滤泡细胞(TEC)膜上,近年发现也存在于其他细胞上,如淋巴细胞、胸腺细胞、垂体细胞等。生理情况下,hTSHR与促甲状腺素(TSH)结合,调节甲状腺滤泡细胞的正常功能和生长。遗传和环境作用下,hTSHR结构发生变异,产生了抗原性,引起自身免疫反应,导致自身免疫性甲状腺疾病(AITD)。此时体内出现TSHR抗体(TRAb),TRAb为多克隆抗体,根据其与hTSHR结合后的效应不同分为甲状腺刺激性抗体(TSAb)和阻滞性抗体(TSBAb)。检测体内的TRAb对AITD的诊断、治疗及预后评价均有重要意义。hTSHR为G蛋白偶联的大分子糖蛋白,分为膜外区、跨膜区和膜内区三部分。膜外区有418个氨基酸,其中有9个亮氨酸富含区、一个N末端和一个信号肽,前21个氨基酸为信号肽呈疏水性,但整个膜外区呈亲水性,主要作用为与配体结合活化受体。TRAb抗原决定簇主要存在膜外区,TSAb的抗原决定簇主要位于TSHR-ecd N-端,而TSBAb的抗原决定簇主要位于TSHR-ecd C-端。跨膜区有264个氨基酸,呈疏水性,有七个跨膜段,膜外3个环和膜内3个环。膜内区有82个氨基酸,有一个C端和C激酶磷酸化位点。跨膜区和膜内区主要作用为辅助受体的活化、传递活化信号及与G蛋白结合而启动细胞内信号传导系统。 目的 由于TSHR抗原决定簇主要集中在膜外区(TSHR-ecd),且目前大量的研究已确定TSHR-ecd氨基端是TSAb的重要靶区。本研究在对大肠杆菌E.coliBL21 StarTM(DE3)中表达的硫氧还蛋白融合的TSHR-ecd氨基端蛋白(TrxTSHRn),进行分子量鉴定和Western blot鉴定,以此蛋白为抗原建立TRAb的ELISA检测方法并初步应用于临床。 方法 1.蛋白的鉴定