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研究背景:白血病(leukemia)是血液系统排名首位的恶性疾病,也是成人前十大常见恶性肿瘤的一种,其发病率及死亡率呈逐年上升的趋势。我国作为世界第一人口大国,具有国际上最庞大的白血病群体,治疗白血病所花费的巨额医疗费用和为此付出的巨大精力,使患者及其家庭背负巨大的经济和精神压力,同时也使得国家医疗负担日益加重,成为目前不容忽视的社会问题。白血病的发病机制十分复杂,到目前为止,尚不能完全将之阐述清楚。根据现有研究对病人进行危险度分层并进行相应的治疗,部分患者仍存在耐药和复发的问题,提示我们需要进一步探索白血病新的发病机制。最近的研究表明,骨髓造血微环境的变化也是白血病发病机制中的重要因素,而骨髓血管新生是骨髓造血微环境改变的一项重要病理过程。多项研究证实白血病中存在明显的血管新生。血管新生的细胞和分子调节机制在各种恶性肿瘤间存在许多共性,表现为诱导因子表达上调,而抑制因子的表达则相对减弱。血管新生过程的相关分子机制极其复杂,包含众多信号通路,目前尚未被详尽阐明。我们都知道,编码基因的表达水平受到上游miRNA的调控,目前已有很多文献证实miRNA的表达异常和血管新生的发生发展有着密切的联系,因此探索靶基因相关miRNA是研究靶基因的核心环节。根据Salmena等提出的竞争性内源RNA(ceRNA)假说,长链非编码RNA(LncRNAs)通过自身miRNA应答元件(MREs)竞争性结合miRNA,调控有关基因的表达。提示lncRNA重要的作用之一就是起到miRNA海绵作用,调控靶基因表达。综上所述,lncRNA-miRNA-mRNA这样的ceRNA机制值得我们进行研究。研究目的:血管新生对于各种生物过程是必需的,包括肿瘤血液供应递送、癌细胞生长、侵袭和转移。最近有研究发现,在食管癌及黑色素瘤中lncRNA PVT1可通过ceRNA机制作用于miR-26b,从而影响肿瘤的发生、转移、血管新生等过程。然而,PVT1调节血管内皮细胞血管新生的具体潜在分子机制仍有待阐明。研究方法:1、为了确定miR-26b对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞增殖、迁移和血管形成的影响,将miR-26模拟物或miR-26b抑制剂转染到HUVECs中。分别采用MTT法,Transwell迁移法和体外血管的小管形成实验法,研究miR-26b在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞增殖、迁移和血管形成中的作用。进行逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(western blotting)以定量靶基因的信使RNA(Messenger RNA,mRNA)和蛋白质表达水平。随后使用双荧光素酶报告基因研究miR-26b与CTGF的3’-UTR的相互作用。2、为了确定PVT1对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞增殖、迁移和血管形成的影响,构建PVT1过表达(pEX2-PVT1)和PVT1敲减(sh-PVT1)的HUVECs。分别采用MTT法,Transwell迁移法和体外血管的小管形成实验法,研究PVT1在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞增殖、迁移和血管形成中的作用。进行逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-26b和靶基因的mRNA表达水平变化,并使用蛋白质印迹法(western blotting)以定量靶基因的蛋白质表达水平。随后使用双荧光素酶报告基因研究PVT1和miR-26b的相互作用。研究结果:1、miR-26b的过表达在Transwell细胞体外侵袭实验中抑制了HUVECs的细胞迁移(P<0.05),而抑制miR-26b的表达水平则促进这种迁移(P<0.05)。细胞增殖试验(MTT法)结果证实,过表达miR-26b的HUVECs细胞的细胞增殖活性显著减少(P<0.05),相反,miR-26b的消耗增加了HUVECs的细胞增殖能力(P<0.05)。通过对不同组HUVECs的成管长度、成环数、覆盖面积、结点数进行测量和记录,并进行统计学分析,结果显示,miR-26b过表达减少了血管的长度(P<0.05)。RT-qPCR和western blotting结果显示,与模拟物阴性对照组相比,miR-26b过表达导致CTGF和ANGPT2的mRNA和蛋白表达水平降低。双荧光素酶实验证实,miR-26b能够识别并结合野生型CTGF 3’-UTR,导致荧光素酶的活性降低(P<0.05),而加入突变型载体组的荧光素酶强度没有改变。2、与对照相比,PVT1过表达细胞(pEX2-PVT1)具有更高的迁移能力(P<0.05),而PVT1敲减细胞(sh-PVT1)的迁移能力减弱(P<0.05)。MTT法结果证实,PVT1过表达(pEX2-PVT1)显著促进HUVECs的细胞增殖(P<0.05),而PVT1低表达则损害HUVECs的细胞生长速率(P<0.01)。体外血管形成实验结果表明,与PVT1敲减细胞(sh-PVT1)相比,PVT1过表达(pEX2-PVT1)促进体外血管形成(P<0.001)。RT-qPCR结果显示,PVT1过表达(pEX2-PVT1)导致miR-26b的表达水平降低(P<0.01)而CTGF和ANGPT2的mRNA表达水平增加(P<0.05和P<0.01),而缺乏PVT1的细胞表现出升高的miR-26b水平(P<0.05)和下调的CTGF和ANGPT2的mRNA水平(P值均<0.05)。western blotting结果显示,PVT1过表达(pEX2-PVT1)的HUVECs中CTGF和ANGPT2蛋白表达水平增加,而PVT1敲减(sh-PVT1)的HUVECs中CTGF和ANGPT2蛋白表达水平降低。双荧光素酶报告基因测定证明,仅野生型PVT1显著降低miR-26b的荧光素酶活性(P<0.05),结合位点突变后的PVT1不改变miR-26b的荧光素酶活性。研究结论:1、过表达miR-26b可抑制HUVECs细胞株的细胞增殖、迁移和血管形成。2、miR-26b通过下调CTGF和ANGPT2在HUVECs的血管新生中起到抑制作用。3、miR-26b直接作用于CTGF的3’-UTR区域,抑制CTGF的转录。4、过表达PVT1可促进HUVECs细胞株的细胞增殖、迁移和血管形成。5、lncRNA PVT1直接作用于miR-26b,使miR-26b表达下调。6、lncRNA PVT1扮演着miR-26b吸附海绵的作用从而促进CTGF和ANGPT2的表达,最终达到促进血管新生作用。