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柑橘是一种重要的经济作物,但对盐胁迫较为敏感,尤其对含氯的盐分敏感。柑橘在盐胁迫下会积累大量的Na+和Cl-,导致植株光合下降、生长变缓并最终降低产量和果实品质。前人对柑橘耐盐性的研究主要集中在砧木上,而对不同柑橘品种间耐盐性的研究较少。此外,尽管Cl-转运在柑橘耐盐中起重要作用,但参与Cl-转运相关基因的研究还很缺乏。本研究比较了四个常见柑橘品种对NaCl胁迫的生理响应,分析了四个C1-转运相关的基因在这些盐胁迫品种叶片中的表达。此外,本研究在枳中克隆了其中的两个基因：PtrCLC和PtrCCC,并分析了基因的表达模式。为进一步研究基因在Cl-平衡中的作用,我们还将PtrCLC和PtrCCC分别在模式植物中进行了过表达,并分析了转基因植株和对照植株在盐胁迫下的表现。本研究的主要结果如下：1.比较了枳砧甜橙(纽荷尔和伦晚)和宽皮柑橘(鄂柑一号和国庆一号)对不同浓度NaCl (0、30、60和90mmol/L)胁迫的生理响应。结果表明：盐胁迫导致植株的干重、叶面积和净光合速率下降,但宽皮柑橘的下降幅度较小。与甜橙相比,宽皮柑橘叶片中积累的Na+和Cl-较低,而两种离子在植株根中的积累量较高。盐胁迫也导致品种间主要矿质元素含量的变化,而宽皮柑橘叶片中Ca和Mg的下降幅度低于甜橙。2.利用同源克隆法从枳中分离了一个CLC基因：PtrCLC。该序列包含2367bP的ORF,编码一个含789氨基酸的多肽。PtrCLC蛋白与其他物种CLC序列的一致性较高,该蛋白还含有10个跨膜区和两个CBS结构域。Real-time PCR分析表明PtrCLC在枳叶片和根中都有表达,同时该基因的表达在ABA、4℃和NaCl处理后上调。此外,在拟南芥AtCLCc突变体clcc中过表达35S::PtrCLC后发现,转基因植株的种子萌芽率在盐胁迫下得到提高。此外,在200mmol/L NaCl处理下,转基因拟南芥鲜重、电解质渗透和叶绿素含量的下降都小于突变体和野生型植株,并且转基因植株根部和地上部的C1-含量均低于突变体和野生型植株。3.为获得柑橘CLC基因家族的所有成员序列,我们用PtrCLC序列检索甜橙基因组数据库,共得到6个CLC基因序列。在枳中克隆验证了另外5个CLC基因。这6个CLC蛋白(PtrCLC1-6)长度在748-798个氨基酸之间,但成员之间序列差异较大。进化分析表明PtrCLCs可分为两个亚类,而PtrCLC4和PtrCLC6与细菌CLCs的关系相对较近。在大肠杆菌EcCLCA中,有三个与Cl-选择性吸收相关的位点：丝氨酸S107、谷氨酸E148和谷氨酸E203。序列比对发现,PtrCLC1在S107相对应位置为脯氨酸(P177), PtrCLC3在E148相对应位置为丙氨酸(A213),PtrCLC4和PtrCLC6在E203相对应位置分别为苏氨酸(T260)和丝氨酸(S295)。Real-timePCR分析表明PtrCLCs在枳叶片中偏好性表达,尤其是PtrCLC6.此外,我们分析了PtrCLCs对缺氮、NaC1和ABA处理的响应情况。缺氮后,PtrCLCs的表达都下调,而PtrCLCl在补充2mmol/L NO3-可后恢复表达。相反,NaCl处理导致PtrCLCs表达量增加,但PtrCLC2和PtrCLC4增加更明显,同时这两者也能够被ABA诱导上调表达。4.利用同源克隆法从枳中分离了一个CCC基因,PtrCCC。该序列长3438bp包含2943bP的ORF,编码一个含980氨基酸的多肽。PtrCCC蛋白含有11个跨膜区域。进化分析表明,PtrCCC与动物的KCC类转运蛋白进化关系较近。Real-timePCR分析表明PtrCCC在枳叶尖和根尖等幼嫩组织中的表达量高于成熟组织。此外,其表达能被KCl胁迫诱导上调。我们进一步将PtrCCC转入野生型烟草中进行基因的功能验证。在NaCl、KCl和NaCl+KCl胁迫下,转基因植株的生长表现都好于野生型植株。同时,在这三种盐胁迫尤其是在KCl胁迫下,转基因植株的根干重和地上部干重的积累都高于野生型植株。