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研究背景及目的： 肿瘤基因治疗是目前有关肿瘤治疗的临床前期和临床研究中发展最为迅猛的领域之一。在过去的十年里，有多达两百七十个肿瘤基因治疗的临床试验在全球范围内开展。但其结果总的来讲是令人失望的。载体的靶向性差和传输效率低下是严重限制肿瘤基因治疗得到更广泛应用的两个主要的障碍。一种新的经基因工程改造的病毒载体的出现使局面为之一新，这就是以ONYX-015为代表的肿瘤特研究背景及目的：异性增殖型病毒载体。该类病毒利用肿瘤生物学行为上的一些异常表现，或是对病毒的基因组进行缺失突变，或是以肿瘤／组织特异性启动子／增强子为“开关”对一些在病毒的生活周期中至关重要的基因进行调控，使病毒可以在肿瘤细胞内特异性地复制，而不影响正常细胞。腺病毒可感染处于各种生活周期的细胞，而且还具有宿主范围广、致病性低、不整合到人类基因组以及滴度高、易于纯化和制备等诸多优点，因此有关于利用腺病毒作为抗肿瘤制剂的的研究受到了极大的关注。前面提到的ONYX-015就是E1B-55kD缺失的腺病毒，它利用多数人类肿瘤细胞p53功能不良的特点，可以特异地杀伤p53缺失或变异的肿瘤细胞，而对于p53~+的正常细胞没有影响。虽然对其杀伤肿瘤的确切机制还存在着争议，但其治疗效果是肯定的，在其联合常规化疗(5-Fu、顺铂)治疗30例复发的头颈部肿瘤患者的临床实验中，临床有效率达到了63％，这是迄今最为有效的肿瘤生物治疗的临床报告。但由于肿瘤和病毒在生物学性状上极其复杂，其作为单剂的治疗效果却并不很理想，＜15％。因此，联合其它的一些治疗手段是非常必要的。除联合化疗以外，以增殖型病毒作为转载抗癌基因的平台(我们称之为病毒-基因第二军医大学 中 文 摘 要 硕士学位论文一治疗）进行抗肿瘤治疗也是一种非常有前景的治疗方案。该方案充分利用增殖型病毒体积小、弥散能力强以及可以特异地在肿瘤细胞内复制等一些特点，将抗癌基因携带至肿瘤病灶局部，在病毒复制增殖的同时使抗癌基因大量表达有抗癌活性的基因产物，在肿瘤局部形成高浓度，却不增加系统中的细胞因子水平，从而使许多剂量依赖型的细胞因子（ILS，IFNS）可以在不增加毒性的情况下充分发挥其抗肿瘤活性。目前己有多个研究小组开始利用肿瘤特异性增殖型病毒携带一些抗癌基因（如，HSV－tk、白介素－2、白介素－5及细胞色素P450等）进行肿瘤治疗的临床前期研究。在对众多具有抗肿瘤活性的细胞因子加以甄别和筛选之后，我们选择了抗肿瘤效果明确对人类又无种属特异性的小鼠IL－正二基因。 近年来，IL－12以其在免疫系统中的重要地位及其所显示出的强大的抗肿瘤活性，引起了人们极大的研究兴趣。在所有的己知的细胞因子中，IL－12具有最强的抗肿瘤活性。它可以增强细胞毒性T细胞和NK细胞的活性，诱导IN’－－－－Y和其他细胞因子的产生，促进 Tho细胞向 Th细胞转化（后者启动细胞介导的免疫反应，同时抑制B细胞介导的体液免疫），还具有抗新生血管的作用。在对不同实体肿瘤的荷瘤小鼠模型的实验中，经系统途径给予 IL－12后可使肿瘤明显消退，并可减少转移的发生。但在＊期临床实验中，因其会引起严重的出血、肝毒性和肌痛等一些副作用，从而限制了它作为抗肿瘤药物的进一步应用。因此，在不增加系统中IL－12水平的情况下，在肿瘤局部形成高浓度，是IL－12能否成功应用于临床的关键所在。为此，我们设计了以增殖型腺病毒为载体携带小鼠IL．12基因的治疗方案，并在体外就其对肝癌的治疗效果进行评估。这样做的好处是：一方面，利用肿瘤特异性增殖型腺病毒特异地靶向肿瘤并可复制增殖的特点，使小鼠IL－12基因在肿瘤细胞内高度表达，并与增殖性腺病毒一起产生相加或协同的作用；另一方面，利用L－12抑制体液兔疫的活性减少体内中和抗体的产生，进一步增强增殖型腺病毒载体的转载效率。方法： ①坯用SOE（SpliCCdOVCflapCstCllsi…技术构建了重组小鼠IL．12基因，并将 4第二军医大学 中 文 摘 要 硕士学位论文其成功克隆至我们自己构建的可携带目的基因的肿瘤特异性增殖型腺病毒载体中，经 PCR测序正确后，命名为 C毗200－mIL刁。②利用 AdEasy”系统 （TongChuan He，1998）构建了非增殖型腺病毒载体，经 PCR和酶切鉴定正确后，命名为Ady－mIL－12。③在体外，通过CPE、MTT检测（分别按不同的MOI值和不同的时间段）以及病毒增殖试验对Ady－mILl、ONYX｛ 和CNHK200－mIL刁 三种病毒对人正常肝细胞株L02、人肝癌细胞株HepGZ和Hep3B的杀伤作用进行了评估。④通过蛋白质印记分析和 ELISA（EllZyme一inkedlmmunosorbant assay）对 Ady－mIL刁2和 CNIDC200－mIL刁2两种病毒感染人肝癌细胞株HepGZ和 Hep3B后小鼠 K42表达量进行了检测。体外实验结果：1．感染细胞能力 荧光显微镜下动态观察的结果表明，三种病毒均可以感染人肝癌细胞株HepGZ、Hep3B?