牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛分支杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)引起的一种人兽共患慢性传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物传染病,我国将其列为二类动物疫病。目前尚无有效的早期诊断试剂和保护性疫苗来预防该病。牛结核病严重影响动物的健康,给畜牧业带来巨大经济损失。该病可以通过乳制品等途径传染给人类,对人类的健康造成威胁。因此寻找一种快速检测牛结核病的方法,对预防和控制结核病也具有重要的意义。生物传感器是近年迅速发展起来的快速诊断致病因素的一项新技术,此类检测方法具有耗时少、敏感性及特异性高等优点,广泛应用于疾病诊断、食品卫生监督、动物疾(疫)病检测、环境监测等广大领域中。免疫传感器作为生物传感器技术的一种,将电化学放大作用和免疫电极的特异性结合,使其不仅具有电化学分析的高灵敏度,还具有免疫识别的高特异性。因此本课题通过分离纯化牛分支杆菌RCE融合蛋白,并以RCE蛋白作为抗原制备了牛分支杆菌的单克隆抗体(McAb),利用纳米金功能化碳纳米管敏感膜制备基于RCE抗原和Mbovis McAb两种电化学免疫传感器,用于牛结核病的诊断研究。主要研究内容和结果：1.牛分支杆菌RV3872-cfp10-esat-6(以下简称RCE)融合蛋白的表达与纯化利用表达载体pET-28a-RCE在大肠杆菌(E. coli BL21)中进行表达,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化分离出较高纯度的RCE融合蛋白；经Brandford法测定RCE融合蛋白浓度为1.3910mg/ml;经Western blot鉴定该蛋白具有较高的抗原活性。2.牛分支杆菌单克隆抗体的制备利用纯化的RCE蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术,经过5次细胞融合,利用自建立ELISA法筛选出3株能分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞5E5、5D5、5D7,并将5E5细胞注射Balb/c腹腔内,制备了单克隆抗体抗腹水。正辛酸-硫酸铵法纯化该单抗腹水,获得较高纯度的单克隆抗体；经紫外分光光度法测定该单抗浓度为3.089mg/ml;经Western blot分析,该单克隆抗体具有良好的特异性,可以作为诊断抗体制备免疫传感器,应用于牛结核病的早期诊断研究。3.牛分支杆菌RCE融合蛋白免疫传感器的研制电化学免疫传感由于其灵敏度高,操作简单、检测快速等特点具有良好的应用前景。本研究采用层层自组装技术,将带正电荷的硫堇(Thi)染料与带负电荷的纳米金颗粒(nano-Au)通过静电作用和共价键合作用吸附到Nafion-MWCNT膜修饰的玻碳电极(GCE)表面,制备了nano-Au/Thi/Nafion-MWCNT敏感膜,然后再通过nano-Au对蛋白的吸附作用,将RCE蛋白固定于电极表面,建立了基于牛分支杆菌RCE蛋白的电化学免疫传感器,以循环伏安法(CV)作为免疫电极表征和定性判定的方法,测定免疫反应前后还原峰电流下降的比例(k),以实现对血清样本中抗体的检测。经试验条件优化,该传感器的最佳RCE抗原固定浓度为500μg/ml,抗原抗体反应时间为60min.该免疫传感器对RCE多克隆抗体具良好的响应性能,其还原峰电流的降低率k随着抗体浓度的降低而逐渐变小,在抗体稀释度为1：80-1：2560范围内呈线性关系,其线性回归方程为k=3.875InC+71.625,R=0.9976:该传感器在灵敏性(RCE抗体在20480倍稀释时,Elisa检测不出阳性,而免疫传感器能检测出阳性)、特异性(RCE抗体引起的k值(47.1%)远大于其他几种杆菌引起的k值)、重复性(批内和批间变异系数分别为1.51%和2.97%)方面都表现出良好的效果；通过对阴性血清的测定,初步建立了该免疫传感器对牛分支杆菌感染阴阳性判定标准(k＜15.4%判为阳性,k<15.4%判为阴性),并用于牛血清样品的检测。其检测结果与ELISA试剂盒检测结果相符率为100%。此研究证明应用电化学免疫传感器实现对牛结核病的检测是可行的,为进一步改良并开发出临床应用型检测牛结核病的免疫传感器奠定了基础。