上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一种I型跨膜蛋白,分子量约为40kDa,在第八届人类白细胞分化抗原专题会议中,被命名为CD326。EpCAM的胞膜外区和胞浆区都具有重要功能。胞膜外区主要发挥黏附作用,参与细胞的增殖和迁移。其胞浆区可以作为信号转导分子,调节正常或肿瘤细胞中细胞周期蛋白的生成,从而发挥信号转导作用。在正常情况下,人EpCAM仅表达于上皮组织;而在病理情况下,EpCAM在多种肿瘤和炎症相关组织中表达。无论在胚胎发育和分化过程中,还是在正常情况下以及炎症和肿瘤等病理条件下,EpCAM表达都会发生动态的变化。EpCAM表达的变化不但对肿瘤细胞增殖、分化等功能起着重要的作用,而且对不同肿瘤具有不同意义,其高表达会导致某些肿瘤的恶性程度增强,在另一些肿瘤中作用则可能相反。此外,EpCAM可以作为胚胎干细胞和某些实体肿瘤干细胞的表面标志物之一。根据不同的表达情况,EpCAM可能成为某些肿瘤诊断及判断预后的标志物。EpCAM作为靶点在抗肿瘤治疗中一直受到重视。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展,针对EpCAM的肿瘤靶向治疗方案不断更新,从上世纪80年代最早应用于临床的鼠源性单抗,已发展到目前的单链抗体、嵌合抗体和完全人源抗体。其中,2009年Catumaxomab已经在欧洲通过临床试验和审查,开始用于临床肿瘤疾病的治疗。目前国内尚未见有EpCAM的治疗性抗体的相关研究。本文主要以EpCAM基因工程抗体的制备和应用为主要研究内容。首先,我们从抗EpCAM抗体中,筛选出5株(FMU-EpCAM-2A9、4E4、4A11、2D7和4F6)可与天然EpCAM分子结合的抗体作为构建基因工程抗体的侯选亲本抗体。从其中4株杂交瘤细胞系中,成功克隆出单抗FMU-EpCAM-2A9、4E4、2D7和4F6的轻链和重链可变区基因。选择单抗FMU-EpCAM-2A9的轻链和重链可变区基因为模板,构建了单链抗体原核表达载体GST-scFv2A9,表达并纯化了GST-scFv2A9融合蛋白。采用流式细胞术、ELISA等方法证实了该融合蛋白具有与天然EpCAM分子以及原核重组表达的EpCAM分子结合的活性。在此基础上,构建了免疫毒素原核表达载体即单链抗体(GST-scFv2A9)-绿脓杆菌外毒素PE(PE38KDLE),简写为GST-scFv2A9-PE或GST-APE;表达、纯化了免疫毒素融合蛋白GST-APE,切除GST标签,进一步证实免疫毒素APE不仅可与天然EpCAM分子以及原核重组表达EpCAM分子相结合,而且可在体外发挥杀伤表达EpCAM分子的肝癌细胞系HHCC细胞的作用。至此,我们采用分子生物学及免疫学方法制备并鉴定了针对EpCAM的基因工程抗体,为开发出具有我国自主知识产权的针对EpCAM的治疗性抗体打下重要的基础。此外,本研究分析了EpCAM分子的胞浆区Ep-ICD和胞膜区的EpEx,在不同组织学分型的胰腺癌组织中的表达分布规律。首次发现在胰腺癌中EpCAM表达与肿瘤的组织学分型有关。预后较差的低分化程度的肿瘤组织胞膜EpEx和Ep-ICD表达均降低,而胞浆、胞核Ep-ICD表达均增高。高分化胰腺癌胞膜EpEx表达增高,提示其可能作为EpCAM基因工程抗体的治疗靶向。