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实验背景与目的:膀胱出口部分梗阻(partial bladder outlet obstruction,pBOO)后,膀胱组织在慢性压力负荷作用下,逼尿肌肥大、增生,来源于间充质细胞的成纤维细胞活化,细胞外基质分泌增加,进一步导致膀胱组织厚度增加、僵硬、胶原沉积,严重影响膀胱逼尿肌的收缩能力。即使患者在通过手术解除梗阻以后,由于逼尿肌收缩能力不能完全恢复,排尿困难症状也不能明显改善,严重影响患者的生活质量。在pBOO进展过程中,多种miRNA的表达发生改变,并参与了膀胱组织重塑。miRNA-21参与心脏、肝、皮肤瘢痕纤维化等疾病进展,有报道miRNA-21在pBOO中表达上调,但是否参与pBOO的膀胱组织重塑尚不清楚,本研究旨在探讨miRNA-21在膀胱出口部分梗阻中的作用及机制。实验方法:(1)利用8周龄Wistar大鼠通过部分结扎膀胱颈尿道移行处建立pBOO大鼠动物模型,且设置梗阻时间梯度。造模结束后观察膀胱组织在梗阻后的重量以及形态学改变;HE染色观察膀胱病理改变;Masson染色观察膀胱胶原纤维的改变;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Ⅰ型胶原蛋白α1链(Col1a1)mRNA水平的表达改变,Western blot检测Col1a1的蛋白表达变化。(2)RT-qPCR分析miRNA-21在pBOO模型中的表达;通过miRNA靶基因预测数据库Targetscan、miRDB、miRTarBase等在线预测miRNA-21的靶基因。通过RT-qPCR分析smad7 mRNA的表达,Western blot分析smad7蛋白水平的表达,分析miRNA-21的表达与smad7表达的关系。(3)分离培养6周龄Wistar大鼠原代膀胱成纤维细胞,体外通过TGF-β1刺激原代膀胱成纤维细胞,RT-qPCR检测TGF-β1刺激诱导后miRNA-21和smad7、Col1a1 mRNA水平表达的变化,Western blot分析smad7、Col1a1的表达。(4)通过原代细胞小核酸转染试剂reFlect将miRNA-21激动剂(Agomir)和拮抗剂(Antagomir)转入原代膀胱成纤维细胞内,检测过表达和抑制miRNA-21后,RT-qPCR分析miRNA-21和smad7、Col1a1 mRNA的表达,Western blot分析smad7、Col1a1蛋白的表达。实验结果:(1)Wistar大鼠在手术建立pBOO模型后,随梗阻时间延长,膀胱重量增加、膀胱壁厚度增加;HE染色显示逼尿肌以肥大改变为主,梗阻时间越长,肥大增生越显著;Masson染色显示pBOO后膀胱组织胶原纤维表达随梗阻时间延长逐渐增加;RT-qPCR和Western blot结果显示Col1a1梗阻后表达增加。(2)RT-qPCR分析显示miRNA-21在梗阻后高表达;miRNA在线靶基因数据库预测发现,smad7是miRNA-21潜在靶基因;smad7在梗阻后低表达,与miRNA-21表达负相关。(3)TGF-β1刺激原代膀胱成纤维细胞后,miRNA-21和Col1a1的表达增加,smad7表达降低。(4)在原代膀胱成纤维细胞中,过表达miRNA-21后,smad7表达降低,Col1a1表达升高;而抑制miRNA-21后,smad7表达上调,Col1a1表达降低。实验结论:膀胱出口部分梗阻后膀胱组织出现纤维化改变,miRNA-21在Wistar大鼠pBOO模型中高表达,与smad7表达负相关。体外实验证实miRNA-21可能通过抑制smad7促进膀胱组织纤维化。