子宫内膜异位症是妇科常见的难治疾病之一,是指具有活性的子宫内膜在正常了宫腔面以外的部位出现和增殖的疾病。近年来发病率有上升的趋势,并趋于年轻化。进行性加重痛经、盆腔疼痛、月经失调及不孕等为其主要临床表现,对患者的身心影响极大。由于其发病机制仍不明确,疗效亦不令人满意,因而从基础到临床的研究均为热点,中医药治疗也成为探讨的热点之一本课题着重探讨桂苓消异方治疗子宫内膜异位症的理论基础,通过初步建立人子宫内膜腺上皮细胞的体外培养方法,研究桂苓消异方药物血清对子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞生长的影响以及Caspase-3表达的影响,进一步探讨桂苓消异方治疗子宫内膜异位症的作用机理,为临床治疗提供重要的理论依据。一、桂苓消异方治疗子宫内膜异位症的理论探讨祖国医学中无子宫内膜异位症的病名,其主要症状与中医的痛经,癥瘕,月经不调,不孕等病症密切相关。认为肾虚是发生本病的根本因素,血瘀是重要的致病因素和病理表现,治疗当以温肾化瘀为主。桂枝茯苓丸原是出自张仲景的《金匮要略》,本意用于妊娠之后癥积害胎,胎元不固者,导师在原方基础上去甘缓之蜜,加仙灵脾温肾阳、血竭粉增强活血化瘀的力量,组成桂苓消异方,治疗子宫内膜异位症,经临床验证疗效满意。本课题用桂苓消异方进行子宫内膜异位症的体外实验研究,为桂苓消异方的临床用药提供理论依据。二、初步建立人子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞的体外培养方法收集2010年10月至2011年10月在扬州市第一人民医院和扬州市中医院妇产科接受手术治疗的子宫内膜异位症或子宫肌瘤患者的在位子宫内膜,分离培养腺上皮细胞并传代,利用显微镜观察细胞生长增殖情况,免疫荧光法鉴定细胞。结果显示,结合采用胶原酶消化法、筛网分离法、选择性贴壁法及二次消化等体外培养技术,成功分离培养出人子宫内膜腺上皮细胞,成功率为75.00%。细胞可传代1-2代,成活4-6周。证实在本实验条件下,体外分离纯化的子宫内膜腺上皮细胞具备良好的增殖能力。内异症与非内异症子宫内膜均可分离培养成功(P>0.05)。2例增生早期内膜由于内膜很少,分离后得到的细胞很少,培养失败,我们根据术前B超提示了宫内膜厚度>5mm选取子宫内膜,且增生晚期和分泌期的子宫内膜腺上皮细胞培养成功率差异不显著(P>0.05)。了宫内膜腺上皮细胞的成功分离培养为揭示子宫内膜异位症的发病机制以及药效学研究建立了良好的实验平台。三、桂苓消异方对子宫内膜腺上皮细胞生长的影响以及培养上清液中Caspase-3含量的影响制备桂苓消异方、孕三烯酮药物血清,以不同血清浓度干预子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞模型,并以MTT法检测对细胞生长的情况。结果显示,桂苓消异方、孕三烯酮药物血清均能抑制子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞生长,桂苓消异方作用优于孕三烯酮。推测桂苓消异方能通过抑制异位病灶组织的细胞生长,促进其凋亡,使异位病灶缩小至消失；亦可促进在位潜在病变内膜细胞凋亡,抑制其种植、生长,起到预防作用。用不同血清浓度干预子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,并收集药物作用24h、48h、72h三个时间段的细胞培养上清液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其上清液中Caspase-3的含量。通过定量检测,证明了体外培养的正常子宫内膜与内异症在位子宫内膜腺上皮细胞均有Caspase-3的表达：内异症在位子宫内膜在增生期时腺上皮细胞Caspase-3的含量显著低于正常子宫内膜(P<0.01)；内异症在位子宫内膜分泌期时Caspase-3的含量与正常子宫内膜相比无差异(P>0.05)。正常子宫内膜腺上皮细胞Caspase-3的含量增生期明显低于分泌期(P<0.01)；内异症在位子宫内膜腺上皮细胞Caspase-3含量增生期明显低于分泌期(P<0.01)。说明Caspase-3的异常表达受月经周期不同时相的影响,其在子宫内膜异位症在位内膜增生期腺上皮细胞的低表达可能是介导发生EMs的重要原因之一。桂苓消异方药物血清能增加增生期子宫内膜腺上皮细胞Caspase-3的表达(P<0.01),且增加幅度随桂苓消异方血清浓度的增高及作用时间延长而越明显。桂苓消异方药物血清亦能增加分泌期子宫内膜腺上皮细胞Caspase-3的表达(P<0.01),且增加幅度随桂苓消异方血清浓度的增高而越明显。这提示了桂苓消异方均可诱导增生期和分泌期在位内膜腺上皮细胞凋亡活动增强,抑制其种植生长能力,从而阻碍EMs的发生。但桂苓消异方药物血清干预的子宫内膜异位症患者的分泌期子宫内膜腺上皮细胞,随着作用时间延长促进作用不明显(尸>0.05),推测可能与分泌期的腺上皮细胞本身有较高的凋亡活动有关。