第一部分IL-5反义寡核苷酸对哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白质表达的影响目的探讨不同序列的IL-5反义寡核苷酸对哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白质表达的影响。方法采用脂质体转染技术，将不同的反义寡核苷酸（AS-1：反翻译起始部位、AS-2：反外显子-2、AS-3：反翻译终止部位）和空白对照导入经密度梯皮法、免疫磁珠法分离的哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞，细胞接种于6孔板，4小时后加入刀豆蛋白A（ConA），培养28小时后，用ELISA和半定量RT-PCR检测细胞培养上清IL-5和细胞内IL-5mRNA的水平。结果（1）相对吸光度比值A（IL-5／β-actin）AS-1组为0.4259±0.0468、AS-2组为0.4330±0.0847、AS-3组为0.4710±0.0823，明显低于对照组1.0288±0.1233（P＜0.01），但反义各组之间差异无显著性意义（P＞0.05）；（2）各组细胞培养上清液中IL-5的含量为AS-1组5.3063±0.6151（pg／ml）、AS-2组4.7345±1.2285（pg／ml）、AS-3组5.9465±1.4520（pg／ml），均明显低于对照组12.1633±3.4257（pg／ml）（P＜0.01），但三组之间差异无显著性意义（P＞0.05）。结论IL-5反义寡核苷酸能够抑制哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白表达；不同序列IL-5反义寡核苷酸抑制作用差异无显著性意义。第二部分反义IL-5重组腺相关病毒真核表达载体质粒pasIL-5／rAAV的构建和转染目的构建反义IL-5重组腺相关病毒真核表达载体质粒pasIL-5／rAAV，并观察转染该质粒对哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞lL-5mRNA和蛋白质表达的影响。方法应用基因重组技术构建pasIL-5／rAAV；通过脂质体介导转染入经密度梯度法和免疫磁珠法分离的哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞，用半定量RT-PCR、ELISA分别检测质粒转染后细胞内IL-5mRNA及细胞培养上清IL-5蛋白质的水平。结果（1）质粒pasIL-5／rAAV经限制性酶切和部分序列测定证明构建成功；（2）质粒组相对吸光度值A（IL-5／β-actin）为0.2683±0.0600，明显低于对照组的A值0.5358±0.1222（n=6，P＜0.01）；（3）细胞培养上清液中IL-5的含量质粒组为5.9437±0.7088（pg／ml），显著低于对照组的8.1117±0.8840（pg／ml） （n=6，P＜0.01）。结论成功构建质粒pasIL-5／rAAV，并且该质粒能够抑制哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白质表达，此实验结果为进一步构建反义IL-5重组腺相关病毒载体及研究哮喘的基因治疗提供了实验依据。第三部分重组腺相关病毒介导的反义IL-5载体构建及其对哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白质表达的影响目的构建含反义IL-5的重组腺相关病毒rAAV-aslL5，并探讨rAAV-asIL5对哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白质表达的影响。方法用基因重组方法构建反义IL-5重组腺相关病毒真核表达载体质粒pasIL-5／rAAV，磷酸钙沉淀法将真核表达载体质粒paslL-5／rAAV、包装质粒pXX2、辅助质粒pXX6共转染入病毒包装细胞293细胞中，合成rAAV-asIL5，Southern Blot测定重组病毒的滴度：将rAAV-asIL5转染经密度梯度法和免疫磁珠法分离的哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞，用半定量RT-PCR、ELISA分别检测转染后细胞内IL-5mRNA及细胞培养上清IL-5蛋白质的水平。结果（1）成功构建并鉴定了重组腺相关病毒rAAV-asIL5，滴度为1.3×10¹¹病毒分子／ml；（2）病毒转染组相对吸光度值A（IL-5／β-actin）为1.0515±0.1477，显著低于对照组的A值1.4271±0.1655（n=6，P＜0.01）；（3）细胞培养上清液中IL-5的含量病毒转染组为12.0840±1.4769（pg／ml），显著低于对照组的15.3590±1.2685（pg／ml） （n=6，P＜0.01）。结论重组腺相关病毒rAAV-asIL5能够抑制哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5mRNA和蛋白质表达，此实验结果为研究哮喘的基因治疗提供了实验依据。总结通过基因工程技术，成功构建插入反义IL-5序列的重组腺相关病毒rAAV-asIL5，并观察到该病毒转染能够抑制哮喘大鼠CD4⁺T淋巴细胞IL-5 mRNA和蛋白质表达。本课题的研究为哮喘的基因治疗提供了新的实验资料。