黑枸杞对高脂诱导的ApoE-/-小鼠非酒精性脂肪肝的作用研究

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近年来,随着人们生活方式和饮食结构的改变,非酒精脂肪肝的发病率呈现上升的趋势,且目前缺乏有效的治疗方案,长期的药物治疗不但加重患者的经济负担并伴有毒副作用。因而从传统中草药中寻找没有毒副作用的活性成分,具有极其重要的意义。黑枸杞作为我国的传统中草药,近年来受到人们的广泛关注。研究发现,黑枸杞具有广泛的抗炎、抗衰老和显著的抗氧化等功效。本文使用醇提法对黑枸杞中的黄酮类物质进行粗提,并探索黑枸杞粗提物对非酒精性脂肪肝的作用效果和可能的机制。主要研究内容包括以下两个方面:1)采用超声波辅助醇提法,制备黑枸杞总黄酮的粗提物,并使用分光光度法,以芦丁为标准对照,测定黑枸杞粗提物中总黄酮含量和体外抗氧化活性。研究发现,在本实验条件下,黑枸杞总黄酮粗提物的提取率达2.84%,并且在一定的浓度范围内,黑枸杞总黄酮粗提物具有很强的DPPH和OH自由基清除率。2)5周龄雄性ApoE null(ApoE-/-)小鼠,随机分成5组:正常组(NC)、高脂模型组(MOD)、高脂膳食+辛伐他汀组(SIM)、高脂膳食+黑枸杞组(LRM)、高脂膳食+辛伐他汀+黑枸杞组(SIM+LRM)。正常组给予基础饲料,其余4组给予高脂饲料,饲喂8W后,NC组和MOD组给予生理盐水灌胃,SIM组、LRM组和SIM+LRM组给予黑枸杞(140 mg/kg)和辛伐他汀(5 mg/kg)灌胃4周。实验结束,眼眶取血,测定小鼠体重、肝重和附睾周围白色脂肪重量,血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、炎性因子和脂肪因子的表达水平,肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性以及丙二醛(MDA)含量。Hematoxylin and Eosin(H&E)染色观察肝组织和脂肪病理形态学改变。肝脏组织冰冻切片油红O染色观察肝细胞的脂质累积情况。RTPCR法检测肝脏组织相关因子的转录水平,Western-blot法检测肝脏组织过氧化氢酶(Catalase1)、超氧化物歧化酶1(SOD-1)、细胞色素P450的表达水平,SAPK/JNK、P38信号通路活性,以及肝脏脂肪代谢相关的PPAR-α、PPAR-γ的表达水平。结果显示:1)与NC组比较,MOD组小鼠附睾周围白色脂重显著增加,白色脂肪组织H&E染色细胞体积变大并伴有高脂血症,肝损指标AST含量显著增加,肝脏脂肪沉积明显,肝脏组织H&E切片中可见明显的脂肪空泡,细胞肿大,排列不整齐,油红染色可见红色脂肪滴的体积显著增大,数量增多。肝脏组织中过氧化产物MDA的含量增加,炎性因子的转录表达增强,SAPK/JNK信号通路激活,JNK1/2的磷酸化水平提高,肝脏组织调节脂肪分化的PPAR-γmRNA的转录水平提高。2)黑枸杞和辛伐他汀进行干预可以显著改善高脂膳食导致的小鼠高脂血症和肝脏脂肪沉积,血脂水平和AST酶的含量降低,H&E染色可见肝脏细胞排列紧密,脂肪空泡的数量显著降低,油红染色图片中红色脂肪滴数量的显著减少。炎性因子的转录和表达降低,SAPK/JNK信号通路受到抑制。肝脏组织中抗氧化酶SOD-1、Catalase1的表达增加,GSH-Px活性显著增强,抗氧化产物MDA的含量显著降低,高脂膳食导致的肝脏脂质沉积得到显著改善,且两者的联合作用效果优于单独干预。同时,SIM+LRM组小鼠体重显著增加,附睾周围白色脂肪生成增多,H&E染色可见脂肪细胞体积显著增大,肝脏组织PPAR-γmRNA和蛋白水平显著增加,PPAR-α的蛋白水平增加。结论:1)黑枸杞粗提物具有一定的体外抗氧化活性,并且在一定的浓度范围内,随浓度升高自由基的清除能力增强。2)黑枸杞和辛伐他汀具有明显的降血脂和减轻肝脏脂质沉积的作用,且两者联合应用效果比单独使用效果更加明显。同时,两者的联合能够促进ApoE-/-小鼠的进食量和体重的增加,附睾周围白色脂肪生成增多。3)黑枸杞联合辛伐他汀可以改善长期高脂导致的小鼠机体的氧化还原状态及慢性炎性状态,上调肝脏中SOD1、Catalase的表达和GSH-Px的活性,抑制炎性因子的表达和SAPK/JNK信号通路的激活。同时上调PPAR-α、PPAR-γ的表达,增加游离脂肪酸的氧化利用和在外周的分布,延缓非酒精性脂肪肝的进展。
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