研究背景和目的：　　一氧化氮（Nitric oxide，NO）为广泛存在于生物体组织细胞中的一种信号分子；由其前体L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）在一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）催化下转化而来。体内有3种NOS亚型；即神经元型NOS（Neuronal NOS，nNOS）、诱导型NOS（Inducible NOS，iNOS）及内皮型NOS（Endothelial NOS，eNOS)。nNOS和eNOS又统称为构成型，为Ca2+-依赖性的NOS，催化合成少量的NO，主要参与生理功能调节；iNOS为Ca2+-非依赖性的，生理状态下很少表达；但可被细胞因子和细菌脂多糖等许多病理因子诱导表达，催化合成大量的NO，参与病理状态的调节。已知NO在心血管、免疫和神经等系统具有广泛的生理、病理作用，尤其是血管内皮细胞合成、释放的NO除了介导内皮依赖性血管舒张，还具有抗氧化、抗血小板聚集、抑制白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖等作用，因此，NO是心血管功能调节重要因子。　　体内存在一种调节NO生成的内源性机制，在组织细胞新陈代谢过程中产生的L-Arg同系物非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA)为NOS内源性抑制物；化学合成的L-Arg同系物 NG-硝基-L-精氨酸（NG-nitro-L-arginine，L-NNA）和NG-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester，L-NAME）为NOS外源性抑制物；它们均可与L-Arg竞争NOS，一方面减少NO生成，另一方面使L-Arg与NOS之间的电子传递脱偶联，使反应中的分子氧（O2）成为唯一的受电子体，从而生成超氧阴离子增多，导致氧化应激增加。我室和国内外学者大量研究表明，内源性ADMA升高与动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、和慢性充血性心力衰竭密切相关；慢性充血性心力衰竭病人血浆ADMA浓度升高与其心脏左室射血分数和左室心功能呈负相关；给成年健康男性志愿者静脉注射ADMA明显升高血压，外周阻力增加，心率降低，心输出量减少。最近我室又研究发现，链脲佐菌素诱导致糖尿病大鼠血中内源性ADMA升高，伴随明显的心率减慢、心脏舒张和收缩功能障碍，左心室射血分数降低。这些研究虽提示，血浆ADMA升高可能与心率减慢、心肌收缩力减弱、心输出量减少有关；但却不能区分上述病理状态下血浆内源性ADMA升高对心脏的抑制作用究竟是通过对心肌收缩力的直接抑制，还是通过收缩血管、升高血压所引起的间接作用所致。　　因此，本研究拟先在体外实验，通过制备离体大鼠左心室乳头肌条，观察内、外性NOS抑制物对电刺激大鼠离体乳头肌收缩的直接作用；然后再在体内实验，通过给正常SD大鼠腹腔注射外源性NOS抑制物L-NNA10周，观察长时间体内高L-NNA模型大鼠的离体乳头肌对电刺激收缩反应的变化；最后在培养的大鼠心肌细胞株H9C2细胞，观察ADMA孵育后对心肌细胞中基础 Ca2+浓度和刺激反应 Ca2+浓度变化的影响以及调节肌浆网内钙释放的雷诺丁受体2（Ryanodine receptor-2，RyR2）基因表达的改变。为阐明NOS抑制物对心血管功能的调节作用以及在糖尿病和心血管疾病状态下内源性ADMA升高的病理作用及其机制提供新的实验数据。　　方法：　　1）离体实验：通过制备大鼠离体左心室乳头肌条，用Muscle Research System记录电刺激（频率1 Hz、波宽5 ms）诱导乳头肌收缩的发展张力峰值；此外，还检测乳头肌中脂质过氧化物产物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和NO代谢产物含量；　　2）在体实验：通过给SD大鼠腹腔注射L-NNA（30 mg/Kg）10周，检测其离体左心室乳头肌对电刺激收缩的发展张力；并用RT-PCR检测心肌RyR2的mRNA水平；　　3）细胞实验：用ADMA孵育培养的H9C2心肌细胞，采用激光共聚焦显微镜检测心肌细胞中基础游离 Ca2+浓度以及给予CaCl2刺激后心肌细胞内反应性Ca2+浓度的变化。　　结果：　　1）离体实验：　　①从正常SD大鼠左心室分离的乳头肌，加静息张力平衡50 min后，第一次电刺激乳头肌产生明显的等长收缩，其发展张力峰值为1.64±0.76 mN；再平衡75 min后，第二次用同样强度的电刺激，仍可使乳头肌产生相似的等长收缩，其发展张力峰值为1.68±0.68 mN；统计学分析表明，正常大鼠乳头肌两次收缩发展张力峰值无明显区别（P>0.05，n=5）；表明从正常SD大鼠左心室分离的乳头肌在间隔75 min平衡前后对频率为1Hz、波宽5 ms强度的电刺激可产生稳定的、可重复性的收缩。　　②用30mmol/L内源性NOS抑制物ADMA孵育大鼠离体乳头肌60 min后，明显抑制乳头肌对电刺激收缩反应张力峰值（P<0.05，n=5）；与此相似，用30mmol/L外源性NOS抑制物L-NNA或 L-NAME孵育60 min亦可明显抑制乳头肌对电刺激的收缩反应（P<0.01，n=5）。　　③用1 mmol/L的NO合成前体L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）或10mmol/L的NO供体硝普钠（Sodium nitroprusside，SNP）预孵育乳头肌15 min，再与30 mmol/L的ADMA共孵育肌条60 min，均可逆转ADMA对电刺激乳头肌收缩的抑制作用(P<0.01，n=5）；L-Arg处理还能改善ADMA引起的乳头肌MDA含量的升高（P<0.05，n=5），而SNP有增加ADMA引起乳头肌NO含量降低的趋势，但无显著性差异。　　④无论是用1mmol/L的蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）抑制剂Chelerythrine（Che），还是用10 mmol/L的抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）预孵育乳头肌15 min，再与30 mmol/L的ADMA共孵育肌条60 min，均可改善ADMA对电刺激乳头肌收缩的抑制作用（P<0.01，n=5）；同时降低乳头肌MDA含量（P<0.05，n=5）。　　⑤用0.1 mmol/L钙离子载体A23187预孵育乳头肌15 min，再与30mmol/L的ADMA共孵育肌条60 min，可逆转ADMA对电刺激乳头肌收缩的抑制作用(P<0.01，n=5），A23187单独孵育乳头肌亦具有正性肌力作用(P<0.01，n=5）；而用3 mmol/L RyR激动剂咖啡因（Caffeine，Caf）或10 mmol/L肌浆网钙泵（Sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）抑制剂环匹阿尼酸（Cyclopiazonic acid，CPA）预处理乳头肌，则可增加 ADMA对电刺激乳头肌收缩的抑制作用(P<0.01，n=5）；用3 mmol/L Caf或10 mmol/L CPA单独孵育乳头肌也抑制电刺激乳头肌收缩（P<0.01，n=5）。　　2)在体实验：与正常对照组相比，腹腔注射外源性NOS抑制物L-NNA的模型大鼠不仅降低整体心肌收缩力和射血分数降低，而且也降低其离体心肌乳头肌对电刺激的收缩反应，使其发展张力峰值明显下降（P<0.05，n=5）；此外，还减少心肌组织RyR2基因转录（P<0.05，n=5），而采用NO的合成前体 L-Arg体内长期治疗有逆转这一作用的趋势，但是没有显著性差异。　　3)细胞实验：采用30mmol/L的ADMA孵育H9C2心肌细胞60 min，既明显降低H9C2细胞内的基础Ca2+浓度（P<0.05），也显著抑制CaCl2刺激所引起的心肌细胞游离钙浓度升高（P<0.01，n=5）。　　结论：　　以上结果表明，内、外源性NOS抑制物无论是在体外或在体内均对正常大鼠离体左心室乳头肌电刺激的收缩反应具有明显的抑制作用，其机制可能与减少心肌NO生成、增加脂质过氧化、抑制RyR2表达和降低心肌细胞内游离Ca2+浓度有关。