随着水稻全基因组测序工作的完成，人们把目标转向的功能基因组的研究，候选基因方法是功能基因组研究的重要方法之一，候选基因来源于不同的物种，在不同种物中又可以交叉使用，本研究候选基因的选用标准为1)候选基因序列在籼稻和粳稻中同时存在；2)在数据库中标注具有某种潜在功能：3)与稻瘟病有关的QTLs在相同的染色体区域。用EMS突变体做为这些候选基因的研究载体。EMS突变为单碱基突变，能够获得一系列等位基因。通过联系等位基因与其表型多态性的关系来确认和评价基因的基本功能。用Agarose-TILLING方法筛选EMS单碱基突变位点。TILLING是由华盛顿洲立大学与美国Fred-Huchision癌症研究中心共同开发的，最初应用到拟南芥的研究上，产取得了成功，2002年第一次引入水稻研究中，2005年改进为Agarose-TILLING。 研究使用2.0％和1.2％两个浓度的化学诱变剂ethylmethanesul fonate(EMS)采用单次诱变和连续诱变的方法诱导水稻IR64种子，构建两个不同的EMS群体-高剂量EMS群体(M<,2>E<2.0>)和再突变EMS群体(M<,2>E<2.0>R<,1.2>)，每个群体包含1600个突变个体。收集并保存了3200份突变体叶片和M<,2>，M<,3>种子，3072份DNA从冻干的叶片中分离出来，形成384个DNA混合池，每个混合池含8个DNA样品。选择11个与稻瘟病相关的候选基因做为研究对象，这些候选基因疑似编码草酸氧化酶(oxalate oxidase)、热激蛋白90(HeatShock Protein 90)和激酶(Kinase)，根据候选基因用CODDLE方法成功设计了11对特异性引物，其中，一次设计成功的引物有5个，其余6个为二次设计引物，引物的二次设计将引物的成功率提高55％。用Agarose-TILLING做为检测单碱基突变位点的方法，本实验使用的CEL1内切酶是从500克新鲜芹菜中提取的，共获得CEL1酶粗液40ml，每一个酶切反应可以使用0.2μL、0.15μL、0.1μL、0.09μL、0.08μL或0.07μL酶粗液，以0.2μL做为本实验中的酶量。Agarose-TILLING共检测到64个单碱基突变位点，经测序后，验证了45个，检测结果可信度为70.3％。再突变EMS群体的单碱基突变位点数(28)高于商剂量EMS群体(17)，突变频率分别为1.29/Mb和0.79/Mb，高剂量EMS突变群体的个体数量达到1300时突变基因可以覆盖整个基因组：再突变EMS群体的个体数量达到800时突变基因可以覆盖整个基因组。再突变群体上的错义突变(5)少于高剂量突突群体(8)，沉没突变和内含子上的无义突变则高于高剂量EMS群体。EMS在外显子区上的诱导变异频率(1.11/Mb)高于内含子上的突变频率(0.97/Mb)。5个EMS突变体M715、M93、M97、M183、M543分别携带5个突变基因ox1-7、ox-4、ox1-6、ox1-9-1、oxl-9-2。突变体问的抗瘟性有显著差异(F=9.98，P<0.01)，抗瘟能力从高到低排列依次为M183(7.3％)、M543(14.6％)、M93(14.7％)、M97(24.7％)、M715(39.8％)。5个突变基因均为稻瘟病防卫反应基因。突变基因ox1-7、ox-4、ox1-6、ox1-9-1、oxl-9-2之间的抗瘟性差异显著(F=3.5626，P<0.01)。与野生基因型比较，基因ox1-9-1抗瘟能力最强，抗病贡献率为48.7％；其次为ox1-9-2，抗病贡献率为19.3％：基因ox-4、ox1-6、ox1-7为感病基因，病叶贡献率分别为4.0％、21.0％和30.0％。按抗瘟能力大小排列依次为ox1-9-1、ox1-9-2、 ox-4、ox1-6、 ox1-7。与相关研究相比具有二个特点，首先是方法创新，利用反向遗传学方法，第一次把EMS突变体技术与以Agarose-TILLING方法结合起来，对水稻功能基因组的研究做了有意义的尝试。Agarose-TILLING方法是本课题组引入到水稻研究中并第一次在本研究L}|应用，相关文章发表在国际刊物《分子育种》上：二是获得了45个单碱基突变等位基因，并对等位基因及非等位基因的抗瘟性进行了评价，这些等位基对抗病育种及稻瘟病基础理论研究都具有积极意义。