绿盲蝽(Apolygus lucorum)是中国最常见的盲蝽之一,是一种杂食性害虫,寄主植物涵盖49科200多个物种,对农业造成巨大的经济损失。嗅觉在绿盲蝽觅食、捕食、躲避天敌、配偶识别、产卵地点选择等行为过程中发挥重要作用,这些行为主要依赖于昆虫灵敏的化学通讯系统和对环境中信息化合物的识别。因此,对绿盲蝽嗅觉展开研究有助于我们深入理解昆虫与周围环境的通讯机制。解析嗅觉识别过程分子机制的第一步是研究在外周神经系统中对化学信息物质进行最初识别和筛选的化学感受相关基因,如气味受体(ORs),它编码的蛋白可特异地识别不同的气味分子。对ORs的功能展开研究可进一步加深我们对绿盲蝽嗅觉系统的认识,并有助于开发一种基于化学生态学的害虫防控策略。本研究选择实验室前人从绿盲蝽触角转录组数据筛选到的ORs基因中的11个为候选基因,分别是AluOR11、16、62、66、69、80、82、90、93、99和 105,通过RACE技术获得这些ORs基因的全长,并对这些基因序列进行克隆验证。采用qPCR技术比较了 11个候选ORs基因在绿盲蝽6种组织中的相对表达水平。利用非洲爪蟾卵母细胞和双电极电压钳系统(TEVC)对候选ORs基因的功能特性进行研究。利用触角电位技术(EAG)记录0-24h未交配雌虫和雄虫对TEVC筛选的候选配体的触角电生理反应。利用三箱嗅觉仪对TEVC筛选的候选配体进行行为活性评价。通过RNA干扰(RNAi)结合行为学实验,对选择的AlucORs和AlucOrco进行功能验证。与其他昆虫ORs相似,大部分候选ORs包含7个跨膜域(TMDs),其中N-端位于细胞内,而C-端位于细胞外;仅AlucOR105具有6个跨膜结构域,并且N-端和C-端均分布于细胞外。多序列比对结果表明,ORs之间氨基酸相似性较低。qPCR分析显示,所有候选的绿盲蝽ORs基因在触角中的表达量显著高于其他组织。其中,AlucOR11、AlucOR16、AlucOR82和AlucOR93基因在雌虫和雄虫中相对表达水平差异不显著,AlucOR62、AlucOR66和AlucOR90在雌虫中相对表达水平分别是雄虫的约1.5倍、2.5倍和1.5倍。AlucOR69、AlucOR80、AlucOR99和AlucOR105在雄虫中相对表达水平显著高于雌性(约2-5倍)。功能研究表明,除AlucOR80外,其余ORs在测试的化合物中均未筛选到候选配体。表达有AlucOR80/Orco的卵母细胞对酯类、醇类、酮类、单萜类和醛类等21种配体产生电流反应。EAG结果表明,这21种候选配体均可以引起绿盲蝽雌虫和雄虫触角的电生理反应。在行为学试验中,1-十五醇、1-十三醇、丁酸乙酯、氨基甲酸甲酯和苯乙酸甲酯这5种组分均不能引起绿盲蝽的行为反应。相比之下,绿盲蝽对(1S)-(l)--β蒎烯、1,8-桉叶油素、二甲基二硫醚和S-(-)顺式马鞭醇表现出趋避行为,其中二甲基二硫醚的趋避效果最为明显,而其他成分均对于绿盲蝽具有吸引作用,其中丁酸丁酯的引诱性最强(雄虫为65%,雌虫为72%)。RNAi分析表明,AlucOR80转录水平在注射AlucOR80 dsRNA后的72h和96h达到峰值(雄虫降低约70%,雌虫降低约80%),并随着注射后时间的延长而降低。Y型嗅觉仪行为实验表明未注射成虫和dsOR80注射成虫之间对两种引诱剂和两种拒避剂的行为反应无显著差异。先前的研究中已证实,AlucOR28可识别8种植物挥发物,其中有三种也是AlucOR80的配体化合物,而本研究证明,在AlucOR28与AlucOR80的三种共同配体中,丁酸丁酯和丙酸丁酯对绿盲蝽具有行为活性。因此我们进一步通过共沉默AlucOR28和AlucOR80来观察绿盲蝽对丁酸丁酯和丙酸丁酯的行为反应变化。与预期一样,在双dsRNA注射72h和96h后,AlucOR28和AlucOR80转录水平显著降低。但在Y管实验中未注射、单注射AlucOR80 dsRNA和双注射AlucOR28和AlucOR80 dsRNA个体均显示对丁酸丁酯和丙酸丁酯的行为偏好性,且这三组之间无显著差异。但与未注射个体相比,沉默ORco基因对绿盲蝽行为活性有显著影响,注射dsORco后AlucORcomRNA水平显著降低,ORco基因沉默个体对于丁酸丁酯和二甲基二硫的行为反应也显著降低。虽然我们的研究结果表明,11个被测试的AlucORs中10个在功能研究中未筛选到合适配体,但并不能判断它们是无功能的。可能由于本实验OR功能研究方法的限制,将来采用更合适的功能研究方法将有助于了解更多关于ORs的信息。而在AlucOR80候选配体中,通过行为分析法筛选出的对绿盲蝽具有吸引和趋避作用的活性物质可为开发基于调控害虫化学通讯的引诱剂或趋避剂提供基础。