论文部分内容阅读
目的:哺乳动物精子发生受到包括激素和生长因子等多种因素的调控,热应激严重损害猪睾丸精子发生和精液品质,但其分子机制尚不清楚。对实验动物大鼠等的研究发现,热应激会导致生精细胞凋亡,线粒体信号通路是细胞凋亡的重要调节途径。本研究的目的是探索热应激是否经由线粒体信号通路起始生精细胞凋亡,进而影响猪精子发生。方法:本研究构建了热应激损伤猪精子发生模型。性成熟长白公猪,经环境热应激处理(每天置37～40℃的猪舍环境3h或40～42 ℃的猪舍环境1h,实验处理时间为7d和42 d)。对照组饲养在20～27℃的猪舍环境。取材到的睾丸组织,部分冻存于液氮中用于总RNA和蛋白质的提取;部分固定于戊二醛用于制作透射电镜切片;部分固定于Bouin氏固定液,用于制备石蜡切片,用TUNEL法原位检测细胞凋亡,用免疫组织化学方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9和Caspase-3表达及定位的变化。结果:1热应激对生精细胞凋亡的影响TUNEL结果显示,精母细胞和精子细胞对热应激处理敏感,与对照组相比,热应激处理组凋亡信号增加,精母细胞、圆形和长形精子细胞凋亡率增加。2热应激对睾丸电镜结构的影响热应激处理影响到生精细胞细胞核和线粒体超微结构,电镜结果示,热处理导致生殖细胞染色质结块和染色质边集;线粒体向细胞核聚集,肿胀等。3热应激对凋亡调节基因和蛋白表达的影响QRT-PCR和Western blotting结果显示,与对照组相比,热应激处理不同程度的导致促凋亡蛋白Bax、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3表达水平的升高;细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2表达也呈上调变化,但未能抑制细胞凋亡的增加。4免疫组织化学研究显示,热应激处理导致Bax在精原细胞、精母细胞和精子细胞的重新分配,从细胞质转移至核旁区。热应激处理前后,Bcl-2优先表达于近管腔部位生殖细胞的细胞质和细胞核。热应激处理导致Cyt-C的胞质内定位更加弥散。热应激导致精母细胞和部分支持细胞Apaf-1阳性反应增强。热应激处理导致减数分裂以后的生精细胞和支持细胞Caspase-9表达量升高。热应激处理导致部分支持细胞Caspase-3的表达,大量生精细胞的细胞核呈Caspase-3阳性着色。结论:环境高温热应激处理诱导猪睾丸生殖细胞凋亡率增加,线粒体信号通路凋亡相关蛋白的表达发生改变。线粒体信号通路参与热应激猪睾丸生精细胞凋亡的调节。