基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因

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变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是一种海水和淡水中均有分布的革兰氏阴性菌,该菌在一些重要的经济鱼类中已被频繁地发现并导致了非常高的死亡率。然而,就目前而言,关于变形假单胞菌致病机制的研究尚处于起步阶段,基于动态互作转录组探索变形假单胞菌致病机理的研究还未见报道。本研究以变形假单胞菌及其感染的斜带石斑(Epinephelus coioides)病理模型为研究对象,以期识别出变形假单胞菌对斜带石斑致病的关键毒力基因,从而增进对变形假单胞菌致病机理以及病原菌与宿主互作的认识。本研究主要内容如下:提取出野生型变形假单胞菌注射斜带石斑后不同时间点不同器官或组织中基因组DNA后,利用数字PCR技术检测病原菌在鱼体内各器官或组织中的分布情况。结果显示,变形假单胞菌在斜带石斑体内主要通过血液传播,然后在短时间内引发全身性感染;同时,变形假单胞菌在大部分组织中的载量变化存在感染初期短暂下降、之后逐渐上升并在注射后第4d达到最大值、然后又下降的动态分布规律。在感染期的大部分时间点,脾脏中变形假单胞菌的载量均比其它组织要高(注射后第4d达到200多倍),该结果表明,变形假单胞菌NZBD9菌株感染斜带石斑的主要靶器官是脾脏,这为本研究中dual RNA-seq技术应用的器官取样提供了良好的导向作用。变形假单胞菌感染的斜带石斑脾脏中RNA被提取出后,对构建的cDNA文库进行dual RNA-seq,之后对所有原始测序数据进行过滤,不同样本中均获得Q20大于97%的高质量测序数据(clean reads)。变形假单胞菌和斜带石斑的clean reads分别被进行差异基因分析后,得到病原菌和宿主差异基因的数量:与纯培养变形假单胞菌相比,该病原菌注射斜带石斑后24、48、72和96h的差异基因数分别为258、10,72、808和894;和未感染斜带石斑相比,被病原菌注射后24、48、72和96h斜带石斑差异基因数分别为66,852、77,771、61,369和73,776。注射后48h筛选到的病原菌和宿主差异基因数均是最多的,且不同感染期病原菌和宿主差异基因的表达水平和数量分布均表现出明显的动态变化。分别对病原菌和宿主差异基因进行加权基因共表达网络分析后,获得的共表达模块被进行KEGG功能富集分析,预测出显著富集的主要毒力相关通路为“细菌分泌系统”和“鞭毛组装”通路,主要免疫相关通路为“补体与凝血级联”、“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”和“造血细胞系”通路。为了识别变形假单胞菌感染斜带石斑的关键毒力基因,首先对主要毒力和免疫相关通路中差异基因进行基因调控网络构建,预测出变形假单胞菌“sec分泌系统”和“鞭毛组装”通路对宿主的致病性有更重要的作用。之后通过基因共表达网络分析进一步预测到“sec分泌系统”和“鞭毛组装”通路中关键毒力基因分别为secY和fliN。动态分布实验显示:和表达无意义shRNA的变形假单胞菌菌株相比,宿主不同组织中secY和fliN沉默菌株的载量在注射后大部分时间点是显著减少的。secY和fliN沉默菌株感染实验发现,secY沉默菌株感染的斜带石斑存活率显著高于fliN沉默菌株感染的存活率,表明secY对变形假单胞菌毒力的影响大于fliN。综上所述,脾脏为变形假单胞菌感染斜带石斑的主要靶器官,dual RNA-seq同时检测到变形假单胞菌和宿主脾脏的动态互作转录组变化,进一步的生物信息学分析和活体实验识别出secY为变形假单胞菌对斜带石斑致病的关键毒力基因。
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