[目的]人ARD1(human arrest defective 1, hARDl)是一种重要的乙酰基转移酶,具有N-末端蛋白质和￡蛋白乙酰化活性,与细胞的分化、DNA修复和维持基因的稳定性密切相关。hARDl在人类多种类型肿瘤组织及其他疾病的研究中均有所表达,近年来逐渐成为研究的热点,但通过shRNA沉默ARD1后对大肠癌裸鼠移植瘤组织中细胞因子和基因表达的研究还较少。本实验通过shRNA沉默ARD1后构建SW620大肠癌细胞裸鼠移植瘤模型,检测大肠癌移植瘤组织中VEGF、bcl-2和TNF-a的表达水平,分析三者与大肠癌之间的相关性,以进一步揭示大肠癌的发病机理,同时为大肠癌的临床治疗提供潜在的新作用靶点。[方法]1.SW620人大肠癌细胞的复苏和培养。2.构建hARD1干扰质粒(pENTRTM/U6-hARDl-shRNA).3.将成功构建的pENTRTM/U6-hARD1-shRNA及无关序列质粒pENTRTM/U6-NC分别转染SW620细胞。利用G418筛选培养基中稳定表达的细胞系。将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为实验组,无关序列质粒整合的细胞克隆为对照组；采用倒置荧光显微镜观察细胞稳定转染情况。4.大肠癌裸鼠移植瘤模型的构建：(依据前期实验结果)阴性对照组与空白组之间裸鼠移植瘤生长情况无明显差异,遂将裸鼠随机分为实验组和对照组,每组8只,两组分别为：皮下注射稳定表达pENTRTM/U6-hARD 1-shRNA的SW620细胞为实验组,皮下注射稳定表达pENTRTM/U6-NC的SW620细胞为对照组,饲养并观察两组大肠癌裸鼠移植瘤生长状况。5.采用Western blot方法检测两组瘤组织中hARD1的表达情况。6.采用免疫组织化学法检测两组大肠癌细胞移植瘤组织中VEGF、bcl-2和TNF-a的表达水平。7.所有数据采用SPSS17.0进行统计学分析,两组间计量资料比较采用t检验或秩和检验,用均数±标准差(x±s)表示,计数资料采用卡方检验,P<0.05为差异具有统计学意义,Spearman等级相关分析三者表达间的相互关系。[结果]1.SW620大肠癌细胞体外复苏和培养成功且生长状态良好。成功构建了hARD1-shRNA重组质粒,经G418筛选出稳定转染的细胞系。倒置荧光显微镜观察对照组和实验组大部分细胞均表达绿色荧光,说明实验组pENTRTM/U6-hARDl-shRNA和对照组pENTRTM/U6-NC均转入SW620人大肠腺癌细胞株,并且富集到稳定表达的细胞。2. shRNA沉默ARD1后大肠腺癌裸鼠移植瘤生长情况本实验共16只裸鼠,随机分两组,每组8只,全部成瘤,成瘤率为100%;在接种后第21d后采用颈椎脱臼法处死裸鼠,仔细分离皮下移植瘤,测量并记录移植瘤重量和体积：结果发现实验组瘤体体积及重量明显小于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3. Western blot方法检测两组大肠癌细胞移植瘤组织中hARD1的表达情况。以GAPDH为内参蛋白,用Image J分析系统软件对Western条带进行定量分析。结果示：两组大肠癌细胞移植瘤组织中均有hARD1的表达,而实验组hARD1的表达明显下降,表明hARD1-shRNA的引入下调了hARD1的表达。实验组与对照组比较hARD1的表达差异有统计学意义(p<0.05)。4.免疫组织化学法检测两组大肠癌细胞移植瘤组织中VEGF、bc1-2和TNF-a的表达情况VEGF主要在细胞浆中表达,少部分表达于细胞核内。实验组VEGF的阳性表达低于对照组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。bcl-2主要定位于细胞的胞浆内,少部分定位于胞膜和核膜上。在对照组中bcl-2的阳性表达明显高于实验组,差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-a表达于细胞质和胞浆内。在实验组TNF-a的阳性表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5. VEGF、Bcl-2和TNF-a在大肠癌裸鼠移植瘤表达的相关性本研究利用Spearman等级相关分析分析了两组大肠癌细胞移植瘤组织中VEGF、bcl-2和TNF-a表达的相关性,结果显示VEGF与bcl-2的表达呈正相关(r=0.683,P<0.01),VEGF与TNF-a的表达呈正相关(r=0.775,P<0.01),bcl-2与TNF-a的表达呈正相关(r=0.882,P<0.01)。[结论]1. shRNA沉默ARD1后可以抑制大肠腺癌裸鼠移植瘤的生长。2. shRNA沉默ARD1后可以影响大肠癌裸鼠移植瘤中VEGF和TNF-a的表达,但并不影响bcl-2的表达。3. VEGF、bcl-2和TNF-a与大肠癌移植瘤的发生发展密切相关,VEGF与bcl-2的表达呈正相关,VEGF与TNF-a的表达呈正相关,bcl-2与TNF-a的表达呈正相关,为进一步对大肠癌的临床治疗提供了潜在的作用靶点。