研究背景慢性肝病是威胁人类生命健康并耗费大量卫生资源的“全球公共健康问题”。肝纤维化是由于肝内纤维生成与降解失衡,致使过多的胶原在肝内沉积,并可发展为肝硬化的一种疾病。目前研究人员多认为活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要来源,肝细胞则是纤维化过程中的受害者。但近年越来越多的研究证明,在体外实验中肝细胞不仅仅是受害者,它还可以通过上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)转变为间质细胞,分沁胶原,生成ECM,促进纤维化的发生。EMT是指上皮细胞丢失掉上皮特征(顶-基底极性,细胞间及细胞与基底膜间粘附性,以及特异性上皮标志蛋白)同时获得间质特征(迁移能力增加,特异性间质标志蛋白)的过程。EMT主要分为三型,I型EMT主要发生在发育过程中,有报道很多物种的原肠胚、神经管的形成,心瓣膜以及肌肉骨骼系统的形成都有赖于EMT过程。III型EMT与肿瘤的形成有关,在实体肿瘤中,肿瘤中央的细胞呈现上皮表型,而周围细胞常分散存在并呈间质细胞表型,这些细胞一旦转移到淋巴结则重新表现出上皮表型。II型EMT在纤维化过程中发挥着重要作用。目前II型EMT的发生已经在肾脏中得到证实,但在体内肝纤维化过程中肝细胞是否可以发生EMT,以及EMT在肝纤维化过程中所发挥的作用还存在较多的争议。肾素血管紧张素系统(RAS)的主要成分包括血管紧张素原(angiotensinogen)、肾素(renin)、血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ)、血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)以及新发现的血管紧张素1-7(angiotensin1-7, Ang1-7)。 AngⅡ是RAS中的一种主要生物活性成分,近年发现AngII与器官纤维化形成以及EMT的发生有着密切的联系,在肾脏中有较多的研究证实AngⅡ可以促进肾脏EMT的发生,Ang1-7与其受体Mas或AT2R结合可以对抗AngⅡ与AT1R结合后产生的作用。而在肝脏中,AngII是否可引起肝细胞发生EMT的改变,最终引起肝纤维化的发生,Ang1-7是否可以通过抑制AngII的作用,抑制肝细胞EMT的改变,并抑制肝纤维化的发生,这一方面的报道目前仍较为少见。目前有研究人员认为,在肾脏中AngⅡ引起上皮间质转化主要是通过smad通路。smad蛋白根据其功能不同分为3类：受体激活型(receptor-activated smad, R-smad),如smad2和smad3;共用介质型(co-mediator smad, Co-smad), smad4;抑制型(inhibitory smad, I-smad),抑制其他二类smads,负反馈地阻断AngⅡ的信号,主要有smad6和smad7。经典的smad通路为：AngⅡ与肾小管上皮细胞ATl受体结合并使AT1受体活化,与ATl受体结合的R-smad蛋白被磷酸化而激活,活化的R-smad穿越胞膜与胞质内的smad4形成异源多聚体而转位进入胞核,与靶细胞DNA上特定的smad结合元件(smad-binding elements, SBE)序列CAGAC结合,调控靶基因的转录。在肝脏中,AngⅡ是否可以通过smad通路引起肝细胞发生上皮间质转变,并最终引起肝纤维化的发生,这一方面的报道仍较为少见。本论文主要研究AngⅡ是否可以通过smad通路引起肝脏EMT的改变,及Ang1-7是否可以通过抑制AngⅡ的作用,抑制肝细胞发生EMT改变,并最终抑制肝纤维化的发生。对慢性肝病的防治有着一定的意义。目的研究在体内以及体外实验中,AngII是否可以通过smad通路引起肝细胞发生EMT的改变,并推动肝纤维化的发生发展,以及Ang1-7是否可以通过抑制AngⅡ的作用,抑制肝细胞发生EMT改变,并最终抑制肝纤维化的发生。方法常规培养的HL-7702细胞系,根据不同实验目的进行下述不同的实验：1、不同浓度的Ang II分别刺激HL-7702细胞系48小时后,用免疫印迹方法(Western blot)检测细胞中波形蛋白(vimentin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、 snail蛋白表达水平的变化；分为对照组、10-6mol/L AngⅡ处理组、10"7mol/LAngII处理组；实验重复3次。2、10-7mol/L Ang Ⅱ分别于不同时间点处理HL-7702细胞系,用免疫印迹方法(Western Blot)检测肝细胞中vimentin、E-cadherin、snail蛋白表达水平的变化。肝细胞系分为：24小时对照组、Ang II处理24小时组、48小时对照组、AngⅡ处理48小时组；实验重复3次。3、AngⅡ刺激HL-7702细胞系48小时后,观察细胞迁移能力的改变。4、HL-7702细胞系分为对照组、AngⅡ刺激组、AngII+Ang1-7处理组、AngII+Ang1-7+A779处理组,用免疫印迹方法(、Western Blot)检测肝细胞中snail、 vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化,实验重复3次。5、HL-7702细胞系分为对照组、AngII刺激组、AngII+Ang1-7处理组、AngII+Ang1-7+A779处理组,用免疫印迹(Western Blot)法检测肝细胞中P-smad2蛋白表达变化,实验重复3次。6、用免疫共沉淀方法检测对照组、AngⅡl刺激0.5小时组及AngⅡ刺激6小时组中与smad4结合的smad2/3蛋白表达改变,实验重复3次。7、HL-7702细胞系分为GFP-siRNA对照组、smad4-siRNA对照组、GFP-siRNA AngⅡ刺激组、smad4-siRNA AngⅡ刺激组,培养48小时后用免疫印迹法(Western blot)检测肝细胞中白蛋白(albumin)、E-cadheirn、vimentin、Ⅰ型胶原(type I collagen)、smad4蛋白含量改变,明确AngII是否可以用过smad通路引起肝细胞发生上皮间质表型转换,实验重复3次。Wistar大鼠根据不同实验目的进行下述不同的实验：8、Wistar大鼠分为假手术组(sham组)和AngⅡ刺激组,分别用生理盐水及AngⅡ以每小时25μg/kg速度持续腹腔泵入,4周后取大鼠肝组织行H-E染色,初步证实AngII可引起大鼠肝纤维化。9、Wistar大鼠分为假手术组(sham组)和AngⅡ刺激组,分别用生理盐水及AngⅡ以每小时25μg/kg速度持续腹腔泵入,4周后取大鼠肝组织用免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠肝组织中vimentin E-cadherin、type Ⅰ collagen蛋白表达水平的变化。10、Wistar大鼠分为假手术组(sham组)和AngII刺激组,分别用生理盐水及AngⅡ以每小时25μg/kg速度持续腹腔泵入,4周后取大鼠肝组织用免疫荧光双染法通过对FSP-1+vimentin、FSP-1+type Ⅰcollagen及albumin+FSP-1、 albumin+type Ⅰ collagen的双染进一步证实肝脏中一部分上皮细胞(其中包括肝细胞)是否发生上皮间质表型转化。11、Wistar大鼠分为假手术组(sham组)、胆管结扎组(bile duct ligation, BDL)以及BDL+Ang1-7组,取肝组织行H-E染色,判断Ang1-7对胆管结扎大鼠肝纤维化的抑制作用。12、Wistar大鼠分为假手术组(sham组)、BDL组以及BDL+Ang1-7组,用Western Blot法检测大鼠肝组织中vimentin、E-cadherin、 type Ⅰ collagen蛋白表达水平的变化,明确Ang1-7对胆管结扎大鼠上皮间质改变的抑制作用。结果1、与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ刺激肝细胞48h后,细胞中E-cadherin表达显著减少(P<0.001),vimentin、snail表达均显著增多(P=0.011,P<0.001)；与10-7mol/L AngⅠI刺激组相比,10-6mol/L AngⅡ刺激肝细胞后E-cadherin表达减少(P<0.001), vimentin、snail表达均增多(P<0.001,P<0.001)。2、培养24小时,与control组相比,10-7mol/L AngⅡ刺激肝细胞后,E-cadherin蛋白含量减少(P=0.036),而vimentin、snail蛋白含量增加(P<0.001,P=0.011)；培养48h后,与contorl组相比,10-7mol/LAngⅡ刺激组中E-cadherin无明显改变(P=0.070),而vimentin、snail蛋白含量明显增加(P=0.007,P<0.001)。3、在琼脂糖中央孔的中心位置,对照组细胞(红色)及AngII刺激组细胞(绿色)分布均匀。在琼脂糖中央孔边缘位置,迁移出中央孔并移动到琼脂糖中的AngⅡ刺激组细胞(绿色)数量明显多于对照组(红色)细胞数量。当对照组(红色)细胞迁移已达到最外缘时,仍有部分AngII刺激组(绿色)细胞继续向外迁移。通过琼脂糖迁移实验,可证明AngII刺激组细胞系迁移能力较对照组明显增强。4、培养48小时后,与对照组相比,AngⅡ刺激组中E-cadherin蛋白表达减少(P<0.001), vimentin、sanil表达增加(P<0.001,P<0.001)；与AngⅡ刺激组相比,AngⅡ+Ang1-7处理组E-cadherin蛋白表达增加(P<0.001), vimentin、sanil表达减少(P=0.001,P<0.001)；与Ang Ⅱ+Ang1-7处理组相比,AngII+Ang1-7+A779处理组E-cadherin蛋白表达减少(P<0.001), vimentin、sanil表达增加(P=0.020,P<0.001)。5、与对照组相比,AngⅡ组中P-smad2蛋白表达增加(P<0.001)；与AngII组相比,AngⅡ+Ang1-7组P-smad2蛋白表达减少(P<0.001)；与AngⅡ+Ang1-7组相比,AngII+Ang1-7+A779组P-smad2蛋白表达增加(P<0.001)。6、与对照组相比AngII刺激0.5h及6h后与smad4结合的samd3蛋白含量增高(P=0.008,P<0.001),差异有统计学意义。与AngII刺激0.5小时相比,AngⅡ刺激6小时后与smad4结合的smad3蛋白含量明显增高(P<0.001),差异有统计学意义。与对照组相比AngⅡ刺激0.5h及6h后与smad4结合的samd2蛋白含量增高(P<0.001,P=0.002),差异有统计学意义。与AngII刺激0.5小时相比,AngII刺激6小时后与smad4结合的smad2蛋白含量减低(P<0.001),差异有统计学意义。7、AngⅡ刺激后smad4-siRNA与GFP-siRNA组比较,smad4-siRNA组中smad4被阻断后,albumin含量显著增高(P<0.001),差异有统计学意义；E-cadherin蛋白含量显著增高(P=0.002),差异有统计学意义；vimentin表达显著降低(P<0.001),差异有统计学意义；type I collagen含量显著降低(P<0.001),差异有统计学意义。8、病理学分析示假手术组大鼠肝组织结构正常,胶原纤维仅存在于汇管区及中央静脉周围；而AngⅡ刺激组纤维组织增多,肝细胞坏死,汇管区炎症细胞浸润。9、与对照组相比,AngⅡl刺激组大鼠肝组织中上皮标志E-cadherii1表达降低(P=0.042),间质蛋白vimentii表达无明显改变(P=0.47)、间质蛋白type I collagen表达增高(P=0.043)10、与对照组相比,ALngⅡ刺激组大鼠肝组织中共表达FSP-l+vimentin、 FSP-1+type I collagen、albumin+FSP-1及albumin+type I collagen的细胞明显增多。11、在假手术组、BDL组、BDL+Ang1-7组中,假手术组大鼠肝组织结构正常,胶原纤维仅存在于汇管区及中央静脉周围；而BDL组纤维组织明显增多,肝细胞广泛坏死,汇管区胶原增生。与BDL组相比,BDL+Ang1-7组中纤维组织减少。12、与对照组相比,BDL组大鼠肝组织中E-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.001), vimentin、type I collagen间质蛋白表达增高(P<0.001,P<0.001),与BDL组相比,BDL+Angl-7组大鼠肝组织中E-cadherin蛋白表达增高(P<0.001),vimentin、type I collagen间质蛋白表达减少(P<0.001,P<0.001)。结论1、在体外实验中,Ang-Ⅱ可通过激活smad通路诱导肝细胞上皮标志减少、间质标志增多,细胞迁移能力增强,肝细胞发生EMT改变。Ang1-7可阻断AnglI引起的EMT改变。2、在体内实验中,AngⅡ刺激大鼠4周后,与假手术组相比,可引起大鼠肝脏上皮标志减少,type I collagen含量增加。通过免疫荧光双染可以看出一些肝细胞共表达上皮与间质标志。Ang1-7可抑制胆管结扎肝纤维化大鼠肝脏上皮细胞减少及间质细胞增多,抑制肝纤维化的发生。