活性氧响应性材料的合成及其载药系统在炎性疾病防治中的应用

来源 :陆军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lisakk
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自上世纪70年代首次提出响应性纳米递药系统的概念后,响应性材料的设计和合成一直是纳米医学关注的热点问题,也已经有了大量关于利用温度、磁场、光照等外源性信号或pH、酶、氧化还原态等内源性信号改变构建响应性递药系统的文献报道。使得包括小分子药物、核酸、多肽在内的多种治疗、成像诊断试剂能够在靶标部位进行特异性的分布和富集。在现有的研究报道中,由于外源性信号的组织穿透能力弱、信号持续能力差以及使用过程繁琐等问题,对长期应用基于外源信号的响应性纳米递药系统带来了限制。而基于炎性疾病部位活性氧(Reactive oxygen species , ROS)水平异常升高所构建的具有靶向诊疗功能的纳米递药系统虽已有所报道,但同时兼具ROS 响应性药物递送能力和 ROS 清除性能的治疗性纳米递送系统鲜有研究。且在现有研究中,缺乏对ROS响应性材料的安全性评价,其构-效关系以及量-效关系的研究也不够具体与深入。  基于以上问题,本课题提出设想:以5种ROS响应性基团苯硼酸频哪醇酯衍生物(phenylboronic acid pinacol ester,PBAP)为响应性单元,分别将其和生物相容性分子β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)键合,得到了包括 5 种不同的 ROS响应性材料OxbCDs;为验证此假设,在成功合成OxbCDs的基础上,我们还对其ROS响应性、清除性以及响应后产物等方面进行深入的表征,由此推断出OxbCDs 的响应过程,并总结了PBAP的种类和接枝数量对其功能效应的影响。接着,以该系列OxbCDs材料,制备得到了相应的纳米载体OxbCDs NP,在其拥有ROS响应性以及清除性的同时,兼具优秀的载药和响应释药特性。再者,通过细胞方面的实验,证明了OxbCDs NP具有抗氧化抗炎作用效果。在动物水平上,一方面以硫酸葡聚糖(Dextran sulfate sodium, DSS)诱导的小鼠急性结肠炎为疾病模型,通过活体成像、激光共聚焦显微镜等技术手段,证明了OxbCDs NP能够向炎症局部进行靶向富集。另一方面,选取SOD类似物 4-羟基四甲基哌啶氮氧化物(4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl,Tpl)、甾体抗炎药地塞米松( Dexamethasone , DXM )以及非甾体抗炎药吲哚美辛(Indomethacin,IND)为模型药物,制备OxbCDs NP载药系统,并对该系统在腹膜炎、急慢性结肠炎等几种小鼠炎症模型中的治疗效果进行全面的评价。最后还通过细胞水平和动物水平等多方面的考察,初步证明了OxbCDs NP具有良好的生物相容性。由此,成功构建了兼具ROS响应性和清除性的纳米递药系统。  方法  1. 活性氧响应性材料OxbCDs的合成  在氮气氛围下,4-羟基苯硼酸频哪醇酯(Compound 1)或4-氨基苯硼酸频哪醇酯(Compound 4)在4-二甲氨基吡啶(DMAP)做催化剂的条件下,与三光气(BTC)反应分别得到相应中间体,再与β-CD进行缩合反应。然后,向反应体系中倒入冰无水乙醚,经过离心以及乙醚洗涤,最终得到相应的OxbCD-1和OxbCD-4。  在氮气氛围下,4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯(Compound 2)或4-羧甲基苯硼酸频哪醇酯(Compound 3)与N,N’-羰基二咪唑(CDI)反应分别得到相应中间体,再与β-CD进行缩合反应。然后,向反应体系中倒入冰无水乙醚,经过离心以及乙醚洗涤,最终得到OxbCD-2,而OxbCD-3则是通过透析冻干得到。  在氮气氛围下,β-CD与N,N’-羰基二咪唑(CDI)反应得到中间体,再与4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯(Compound 5)进行缩合反应。然后,向反应体系中倒入冰无水乙醚,经过离心以及乙醚洗涤,最终得到相应的OxbCD-5。  2. OxbCDs及其水解产物的表征  利用红外光谱(IR)、核磁共振氢谱(1H NMR)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、液相质谱联用(LC-MS)以及热重分析(TGA)等方法对OxbCDs、OxbCDs水解产物以及进行表征。  3.OxbCDs NP纳米粒的制备和表征  基于OxbCDs、DSPE-PEG、卵磷脂三种成分,采用纳米沉淀法构建OxbCDs NP纳米粒。采用透射电子显微镜(TEM)观察形态,动态光散射(DLS)测定粒径和Zeta电位。不同接枝量OxbCDs NP、OxbCDs NP各载药纳米粒的制备方法类似。  4.OxbCDs或OxbCDs NP对不同ROS响应性的测试  OxbCDs或OxbCDs NP分散于羟自由基(·OH),次氯酸根(OCl-),过氧亚硝酸根(ONOO-)以及PBS溶液和H2O2溶液中进行响应性水解,用紫外分光光度计在500 nm处测定其透光率,并用数码相机拍照,记录材料水解情况。  5.OxbCDs或OxbCDs NP清除H2O2能力测试  OxbCDs或OxbCDs NP分别分散于新制备的1 mM H2O2中,于37℃环境下放置24 h后,7200 rpm离心5min,吸取样品上清液根据试剂盒说明书进行检测。  6.OxbCDs NP在不同环境溶液中的水解特性  取OxbCDs NP分别加入不同pH或是含有不同浓度H2O2的PBS中,亦或是加入模拟胃肠道环境的溶液中,500 nm处测定并收集相应时间点溶液透光率,并采用数码相机拍照。同样的,采用类似的方法考察不同PBAP接枝量OxbCDs NP在1.0 mM或50 μM H2O2溶液中的水解特性。  7.OxbCDs NP的细胞水平初步安全性评价  首先,MTT法测试不同剂量OxbCDs NP对小鼠巨噬细胞RAW264.7或小鼠主动脉平滑肌细胞MOVAS-1的细胞毒性。其次,通过流式细胞术检测OxbCDs NP与RAW264.7 细胞共孵育后细胞线粒体膜电位水平。而后,使用荧光显微镜以及流式细胞术等方法对共孵育OxbCDs NP的RAW264.7细胞胞内ROS进行检测,并对其胞外培养基H2O2水平进行测定。通过ELISA试剂盒以及Western Blot检测胞内外炎症因子水平。最后,Transwell小室实验考察OxbCDs NP是否对RAW264.7细胞具有诱导迁移作用。  8.OxbCD-2 NP和OxbCD-5 NP的动物水平初步安全性评价  首先对不同浓度的OxbCD-2 NP、OxbCD-5 NP进行体外溶血实验考察。Balb/c小鼠分别尾静脉注射不同剂量OxbCD-2 NP或OxbCD-5 NP,每天记录体重。15天后,测定血常规,以及肝肾功等指标,脏器称重计算脏器指数,同时进行H&E染色分析。通过IVIS成像以及DHE染色等手段评价OxbCDs NP进行腹腔、皮下、肌肉注射局部氧化应激状态的影响。最后,对小鼠口服OxbCD-2 NP的急性毒性进行评价,分别给予小鼠不同剂量OxbCD-2 NP,14天后,进行血常规以及肝肾功能指标检测,计算器官指数,H&E染色,光学显微镜下观察。  9.OxbCDs NP在细胞水平上的抗氧化效应评价  RAW264.7细胞经PMA刺激后,OxbCDs NP进行干预治疗。使用DCFH-DA溶液对其胞内 ROS 进行染色,分别进行荧光显微镜拍照观察或流式细胞术检测。检测NO与NOS则探针改用DAF-FM DA,操作同上。  10.OxbCDs NP在细胞水平上的抗炎效应评价  RAW264.7细胞经H2O2刺激,OxbCDs NP进行干预治疗。收集培养基,按照碧云天RIPA裂解液说明书对细胞进行裂解。培养基按照ELISA试剂盒说明书分别测定其中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。细胞裂解液进行Western Blot检测。  11.OxbCDs NP对细胞凋亡以及线粒体膜电位的影响  RAW264.7细胞经过OxbCDs NP或catalase预处理2 h。再经过200 μM H2O2进行凋亡处理8 h后,测定细胞凋亡以及线粒体膜电位水平。  12.OxbCDs NP对腹膜炎小鼠模型的疗效评价  向Balb/c小鼠腹腔注射酵母多糖(zymosan)溶液建立腹膜炎模型,1 h后腹腔注射Catalase溶液或OxbCD-2 NP、OxbCD-5 NP、PLGA NP溶液,5h后,腹腔注射lumiol-Na进行IVIS成像。或腹腔注射PBS后进行灌洗,抽取腹腔液3 mL。此腹腔液可按照ELISA试剂盒说明书检测MPO、MCP-1、IL-8、TNF-α以及IL-6含量。根据流式实验需要,向腹腔液中加入红细胞裂解液,分别进行中性粒细胞与巨噬细胞的特异性抗体染色后进行流式细胞术检测。  13.OxbCDs NP对H2O2或中性粒细胞诱导RAW264.7细胞迁移的影响  在 H2O2 或 3%巯基乙酸盐诱导的小鼠腹腔中性粒细胞诱导下, RAW264.7 于Transwell小室中进行迁移,OxbCDs NP进行干预。迁移至下室的细胞用多聚甲醛固定后,用0.3%结晶紫染色。倒置显微镜下随机选择5个视野拍照并进行细胞计数。  14.OxbCDs NP载药纳米粒的制备及其释药行为研究  通过纳米沉淀法制备得到负载Tpl,DXM,IND的OxbCDs NP载药纳米粒。取上述OxbCDs NP载药纳米粒加至不同H2O2浓度的PBS溶液,37℃恒温振摇,并于特定时间点,取释放样品16000 rpm离心10 min,测定上清液中药物含量。使用高效液相色谱仪测定Tpl含量,而DXM与IND含量使用紫外分光光度计测定。  15. DSS或TNBS诱导的小鼠急慢性结肠炎模型建立  C57BL/6小鼠自由饮用3% DSS水溶液7天即可得到小鼠急性结肠炎模型。小鼠先后饮用DSS水溶液和去离子水各5天,重复3个周期后即可得到小鼠慢性结肠炎模型。另取C57BL/6小鼠通过圆头注射器直肠注射 TNBS乙醇溶液,为防止液体漏出,需提着小鼠尾巴倒置30 s,随后正常饮食饮水7天即可得到TNBS诱导的小鼠急性结肠炎模型。  16.OxbCD-2 NP在小鼠急性结肠炎模型中的分布研究  DSS诱导急性结肠炎小鼠口服Cy7.5/OxbCD-2 NP,在不同时间点,处死小鼠,对其胃,肝,脾,结肠以及血液进行活体成像,统计小鼠各器官荧光强度。同样的,给予小鼠口服灌胃Cy5/OxbCD-2 NP 4 h后,取小鼠结肠组织进行包埋,冰冻切片使用荧光共聚焦显微镜观察。  17.OxbCDs NP载药纳米粒对小鼠腹膜炎模型的疗效评价  向Balb/c小鼠腹腔注射zymosan溶液建立模型。1 h后,腹腔注射DXM/OxbCD-2 NP、DXM/OxbCD-5 NP、IND/OxbCD-2 NP、IND/OxbCD-5 NP进行干预。5 h后,按之前的方法取腹腔液测定其中中性粒细胞和巨噬细胞比例以及超氧化物、一氧化氮NO、趋化因子IL-8和MCP-1以及炎症因子MPO、TNF-α和IL-6的水平。  18.Tpl/OxbCD-2 NP对几种急慢性结肠炎小鼠模型的治疗作用评价  C57BL/6小鼠通过DSS或TNBS制造3种小鼠急慢性结肠炎模型。按15 mg/kg Tpl的剂量,每天分别给予口服Tpl、Tpl/PLGA NP或Tpl/OxbCD-2 NP。每日观察记录小鼠体重、粪便情况,实验结束后,处死小鼠,进行血常规和肝肾功能分析,收集包括结肠在内的主要脏器进行切片,H&E染色并评分。检测结肠组织匀浆液中氧化应激相关指标和炎症因子情况,还通过免疫荧光、流式细胞术检测结肠上皮细胞IL-1β、CD98表达情况。  结果  1. 基于β-CD和PBAP,合成了一系列5种ROS响应性材料OxbCDs,并对这5种材料进行了IR、1H NMR和MALDI-TOF-MS表征。其1H NMR显示,根据投料比的不同,β-CD与PBAP的平均摩尔比可以从1∶1,1∶3,1∶5,1∶7进行变化,并且通过MALDI-TOF-MS也得到了相同的结果。即合成得到的OxbCDs NP为不同PBAP接枝量的材料混合物,但平均PBAP接枝量随着PBAP投料比的增加而增加。  2.OxbCDs对H2O2具有特异响应性,并且通过对其水解产物的1H NMR和ESI-MS检测,探明了5种OxbCDs分别的响应性产物。通过LC-MS证明了不同接枝量OxbCDs响应性产物数量与接枝量之间呈现正相关关系。  3. 证明了不同OxbCDs或不同接枝量OxbCDs具有不同的H2O2清除能力。这种能力不仅与 OxbCDs 的种类有关,其中 OxbCD-2 和 OxbCD-5 的清除能力最强, OxbCD-3最弱,分别达到了1.402 ±0.159,1.455 ±0.154,0.874 ±0.051,1.595 ±0.191, 1.886±0.140 μmol/mg,还与PBAP的接枝量呈现线性关系。  4.通过纳米沉淀法制备了5种ROS响应性纳米粒OxbCD-1NP,OxbCD-2 NP, OxbCD-3 NP,OxbCD-4 NP,OxbCD-5 NP,平均粒径分别为92.5±4.2,100.9±3.7, 109.1±6.2,101.6±5.8和111.4±5.7 nm,Zeta电位均在-30mV以下。  5.OxbCDs NP能够在pH 1~11范围的溶液中保持稳定。当H2O2浓度逐渐提高至1 mM时,纳米粒水解速率与程度逐渐升高,透光率提高至80%以上,而OxbCD-3 NP的水解速率是最慢的。同时,PBAP的接枝量与OxbCDs NP的水解速率呈现负相关,即PBAP接枝量越多,水解越慢。  6.OxbCDs NP同样拥有OxbCDs对H2O2的清除性。随着纳米粒质量的增加, H2O2的清除量也随之增加,这种剂量依赖性具有明显的线性关系( R2=0.98)。而不同OxbCDs NP具有不同的H2O2清除效率,除OxbCD-3 NP的效率最低外,其他几种纳米粒则大致相同。  7.MTT实验证明,1000 μg/mL OxbCDs NP与小鼠巨噬细胞RAW264.7或小鼠主动脉平滑肌细胞MOVAS-1共孵育12 h或24 h后,也不会有明显的细胞毒性。流式细胞术证明了OxbCDs NP不会导致RAW264.7细胞线粒体膜电位水平和胞内外ROS水平的改变,并且不会对细胞炎症因子表达情况以及迁移能力产生影响。  8.通过口服、静注、肌注、腹腔、皮下等不同给药途径,初步证明了OxbCDs NP具有良好的体内外安全性。小鼠体重、器官指数、血常规以及肝肾功等指标与正常小鼠无显著性差异,在局部注射也不会导致氧化应激状态的升高。总体在小鼠体内呈现出良好的生物安全性。  9.RAW264.7细胞实验表明了,OxbCDs NP能够降低PMA所导致的细胞ROS水平升高;保护H2O2所导致的NO、NOS和包括TNF-α,IL-1β,IL-6,MCP-1,MIP-2, IL-8 在内的炎症因子表达上调以及细胞迁移增加;防止 H2O2所导致的细胞凋亡增加和线粒体膜电位下降。  10.在小鼠腹膜炎模型中,OxbCD-2 NP和OxbCD-5 NP能够降低小鼠腹腔液中H2O2浓度,中性粒细胞与巨噬细胞的数量和MPO表达水平均出现下降;还通过ELISA实验和Transwell小室实验证明了OxbCDs NP能够降低MCP-1和IL-8等趋化因子和TNF-α、IL-6 等炎症因子的表达水平,降低对巨噬细胞的迁移诱导。综上所述,证明了OxbCDs NP确实能够缓解小鼠腹膜炎。  11. 成功构建了负载SOD类似物Tpl或甾体抗炎药物DXM或非甾体抗炎药IND的载药OxbCD-2 NP和OxbCD-5 NP。粒径大都在100 nm左右,表面zeta电势均呈现负电位。DSC结果显示药物均位于纳米粒内部的疏水核心,且载药量在16.5%~19.7%之间,均比PLGA NP的7.7%~11.4%要高,说明OxbCDs NP具有优秀的载药能力。  12. 无论是疏水性较弱的 Tpl 或疏水性强的 DXM 和 IND,都能在没有 H2O2存在条件下保持稳定,甚至在酸性环境下依然不泄漏,这为OxbCDs NP的口服给药提供了前提。另一方面,相比于没有活性氧响应性的PLGA纳米粒,OxbCDs载药纳米粒则表现出明显的H2O2响应性释药特性,且与H2O2浓度呈现正相关。  13. 体内分布实验证明了,在 DSS 或 TNBS 所诱导的小鼠结肠炎模型中,口服Cy7.5/OxbCD-2 NP能够在结肠炎局部较Cy7.5蓄积得更多,且明显降低血液中的Cy7.5含量。通过对时间的追踪,发现随着口服时间的延长,OxbCD-2 NP在结肠炎局部的聚集情况呈现先增长后减少的过程,4 h后达到最大含量。在24 h的时间内,其累积蓄积量是Cy7.5的5.1倍,而血液中仅有Cy7.5的20%左右。荧光共聚焦显微镜也能观察到Cy5/OxbCD-2 NP具有更好的结肠炎靶向富集作用。  14.在小鼠腹膜炎模型中,与DXM与IND原料药组相比,OxbCDs NP载药纳米粒在治疗上表现出独特的优点。通过对腹膜炎小鼠腹腔灌洗液进行检测,测定其中的中性粒细胞、巨噬细胞比例以及氧化应激和炎症相关指标含量,结果显示,OxbCDs NP载药纳米粒具有明显更优的治疗效果。  15.为评价OxbCDs NP载药纳米粒在口服炎症靶向治疗中的应用,我们建立两种DSS或TNBS诱导的小鼠急性结肠炎模型以及一种DSS诱导的小鼠慢性结肠炎模型,口服Tpl/OxbCD-2 NP进行干预治疗。结果发现,在上述的三种急慢性结肠炎模型中,具有ROS响应性的Tpl/OxbCD-2 NP表现出比Tpl以及OxbCD-2 NP更为优异的抗炎能力,同时对其他器官也并无明显毒性。  结论  1. 成功合成并表征了5种ROS响应性载体材料OxbCDs,并通过纳米沉淀法制备了相应的纳米粒OxbCDs NP;通过系列技术手段,阐明了OxbCDs的具体响应过程,并证明了OxbCDs NP拥有了OxbCDs所具有特异的H2O2响应性和清除性,且这种功能性与其不同的PBAP单元以及不同的PBAP接枝量之间具有密切的相关性,为开发基于苯硼酸酯类ROS响应性载体材料提供了实验依据。  2.得益于OxbCDs NP对H2O2的清除性,在一系列细胞模型以及小鼠腹膜炎模型中均能够明显降低氧化应激程度以及炎症因子表达水平,都说明了OxbCDs NP本身就具有优秀的抗氧化抗炎活性。  3. OxbCDs NP能够以高载药性能负载SOD类似物Tpl以及甾体/非甾体抗炎药物DEX、IND。一方面,这些载药纳米粒可以通过对炎症局部高浓度ROS水平产生响应作用,增强药物被动靶向性;另一方面,还能发挥OxbCDs和药物的协同作用,在小鼠腹膜炎和三种小鼠急慢性结肠炎模型中,能显著减少疾病部位中性粒细胞的浸润,降低氧化应激以及炎症等相关指标,呈现良好的治疗效果。  4. 初步体内外安全性评价表明OxbCDs NP具有良好的生物相容性。  综上所述,本论文基于 β-CD 和 ROS 响应性基团 PBAP 合成了系列载体材料OxbCDs,并以其构建了ROS响应性、清除性的双功能纳米载体OxbCDs NP;较为系统地阐明了PBAP种类以及接枝数对OxbCDs以及OxbCDs NP功能性质的影响;基于一系列的物理化学性质测定、细胞实验以及活体成像和治疗等实验,我们证明了OxbCDs NP在细胞模型以及小鼠腹膜炎模型中的抗氧化、抗炎活性;基于OxbCDs NP对ROS的高载药性能,进一步设计并制备了具有广泛药物适用性的载药OxbCDs NP,通过对炎症部位高水平ROS的靶向富集作用,实现了载药纳米递送系统对小鼠腹膜炎以及三种小鼠急慢性结肠炎模型更为优异的治疗效果。该响应性载药系统制备方法简单高效,适用药物广泛,生物相容性好,因此具有良好的应用前景。另外,OxbCDs NP所具有的双功能性,也为设计炎症相关疾病的靶向药物提供了新的方法。
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