NR4A1是一种应激性蛋白。环境因素或细胞内部生理因素改变,都会导致细胞内NR4A1的诱导表达。胰岛β细胞长期处于高糖和高游离脂肪酸（FFA）的状态下,会引起细胞的内质网应激（ER-stress）及代谢产生的活性氧（ROS）所致的氧化应激。我们课题组以前研究已经证实,NR4A1能够抵抗内质网应激所致的胰岛β细胞凋亡。但是NR4A1是否能抵抗活性氧（或者氧化应激）引起的β细胞凋亡尚不清楚。我们的实验数据显示,用H₂O₂处理MIN6细胞可引起NR4A1蛋白表达升高,而在MIN6细胞中过表达NR4A1能够抵抗H₂O₂所致的细胞凋亡。用基因敲除小鼠（NR4A1 KO小鼠）的胰岛进行验证的结果显示,KO小鼠的胰岛对H₂O₂所致的细胞凋亡更为敏感;小鼠胰岛中80%的细胞是胰岛β细胞。我们还发现用高脂饲料喂养的NR4A1 KO小鼠的胰岛β细胞中氧化应激的标志物[8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）]水平明显高于对照小鼠;TUNEL分析结果表明,NR4A1 KO小鼠的胰岛β细胞发生凋亡的比率更高。我们探讨了 NR4A1抵抗活性氧引起的胰岛β细胞凋亡的相关机制。我们发现与对照细胞相比,高表NR4A1的MIIN6细胞能够抑制H₂O₂诱导的JNK和Caspase 3的活化;高表达NR4A1的MIN6细胞中WT1和SOD1蛋白的表达量也增高了。我们进一步研究发现在WT1基因启动子上存在一个NR4A1的结合位点（-1118bpto-111bp）;免疫共沉淀实验进一步表明,NR4A1和WT1基因启动子有物理性结合。在胰岛β细胞中敲低WT1或SURVIVIN都会导致细胞对H₂O₂所致凋亡的敏感性增高。综上所述,NR4A1可通过上调WT1、SURVIVIN的蛋白表达或降低JNK蛋白的磷酸化来抵抗氧自由基引起的胰岛β细胞凋亡。第一部分在胰岛β细胞中过表达NR4A1可抵抗活性氧所致的细胞凋亡研究目的:探讨活性氧分子H₂O₂是否能诱导胰岛β细胞内NR4A1的表达以及过表达NR4A1是否可抵抗活性氧所致的胰岛β细胞凋亡。研究内容:1.用不同浓度的 H₂O₂ （0μM、50μM、l00μM、2000μM、400μM）处理 MIN6 细胞 1 小时,收取细胞,提取RNA或蛋白质,分别用荧光定量PCR（Q-PCR）和We和Western blot测不同浓度H₂O₂处理MIN6细胞时,NR4A1在mRNA和蛋白水平的改变以及Caspase 3的活性形式在蛋白水平的变化。2.用100μMH₂O₂处理MIN6细胞,分别在不同时间点[Oh、lh、3h、5h （RNA）、7h、9h、12h （蛋白质）]收取细胞,提取RNA或蛋白质,分别用荧光定量PCR （Q-PCR）和Western blot检测不同时间点NR4A1在mRNA和蛋白水平的变化以及Caspase 3活性形式蛋白水平的变化。3.构建高表达NR4A1的慢病毒感染MIN6细胞,用嘌呤霉素筛选并获得稳定高表达NR4A1的MIN6细胞克隆（OV细胞）;用同样方法获得对照细胞（NC细胞）。用不同浓度的 H₂O₂ （OμM、l0OμM、200μM、4000μM、600μM）处理 OV 及 NC 细胞 4 小时,用MTT方法检测两组细胞的存活率;用l00μMH₂O₂处理两组细胞不同时间（0h、1h、2h、4h、6h）,用MTT方法检测两组细胞的存活率。4.用1000μMH₂O₂处理OV及NC细胞,分别在不同时间点（0h、1h、3h、7h、9h、12h）收取细胞,提取蛋白,用Western blot检测不同时间点NR4A1及Caspase 3的活性形式蛋白水平的变化。5.培养过表达NR4A1的稳定MIN6细胞株（OV细胞）及对照细胞株（NC细胞）,加入100μM H₂O₂处理4小时,TUNEL法检测两株细胞凋亡的比率。6.取8周龄的C57BL/6J小鼠做为实验对象,分离纯化小鼠的胰岛,用过表达NR4A1的腺病毒和对照病毒感染纯化的胰岛48小时,用1000μM H₂O₂处理两组病毒感染的胰岛4小时后,用TUNEL法检测胰岛内细胞的凋亡率。7.取8周龄的NR4A1KO小鼠和野生型小鼠,分离纯化小鼠的胰岛,用10μMH₂O₂处理两组胰岛4小时后,用TUNEL法检测胰岛内细胞的凋亡率。8.取8周龄的C57BL/6J小鼠,分离、纯化小鼠的胰岛,将胰岛平均分为两组,两组胰岛分别加入100μM H₂O₂和对照培养基（1640培养基）10min,用免疫荧光方法检测两组胰岛细胞内8-羟基脱氧鸟苷（氧化应激标志物）的含量。9.高脂喂养NR4A1 KO小鼠和野生型小鼠8个月,分离、纯化小鼠的胰岛,用TUNEL法检测两组胰岛细胞的凋亡率;用免疫荧光方法检测两组胰岛细胞内8-羟基脱氧鸟苷（氧化应激标志物）的含量。10.用100μM H₂O₂处理过表达NR4A1的稳定MIN6细胞株（OV细胞）,分别在Oh、3h、6h收集细胞,用核质分离试剂盒把细胞的组分分成细胞浆及细胞核两部分,用Western blot检测NR4A1在细胞内的定位。研究结果:1.用不同浓度的H₂O₂处理MIN6细胞1小时后,NR4A1的mRNA和蛋白水平表达升高,50μM H₂O₂就能引起NR4A1 mRNA水平的明显升高,100μM H₂O₂能使NR4A1的表达到达峰值,蛋白水平随着H₂O₂浓度的升高呈剂量效应;Caspase3活性形式在蛋白水平也明显升高,说明H₂O₂能致使MIN6细胞凋亡。2.用100μM H₂O₂处理MIN6细胞,在不同时间点可观察到NR4A1的mRNA和蛋白水平表达升高,mRNA水平在1h即达到高峰,蛋白水平在3h即有明显升高,9h达到高峰;Caspase 3活性形式的蛋白水平随着时间的延长而升高,说明100μM H₂O₂可导致MIN6细胞发生凋亡。3.我们成功地构建过表达NR4A1的稳定MIN6细胞株,即OV细胞,对照细胞为NC细胞。MTT结果显示,无论是加入不同浓度的H₂O₂还是加入相同浓度H₂O₂处理不同时间,OV细胞的存活率都明显高于NC细胞。4. 100μM H₂O₂处理OV细胞和NC细胞后,Western blot结果显示,NR4A1的蛋白表达量在各个时间点OV细胞都远高于NC细胞;Caspase 3活性形式的蛋白水平随着时间的延长而逐渐升高,但在各个时间点OV细胞中的表达量明显低于NC细胞的表达量。5.用100μM H₂O₂处理OV及NC细胞4小时后,TUNEL结果显示,OV细胞的凋亡率显著低于NC细胞的凋亡率。6.用过表达NR4A1的腺病毒和对照病毒感染胰岛后,加入100μM H₂O₂处理胰岛,MTT结果显示,过表达NR4A1的胰岛细胞的凋亡率显著低于对照组胰岛细胞的凋亡率。7.用100μM H₂O₂处理两组胰岛后,MTT结果显示,NR4A1 KO小鼠的胰岛细胞的凋亡率显著高于野生型小鼠胰岛细胞的凋亡率。8.用10μM H₂O₂和对照培养基（1640培养基）处理两组胰岛细胞10min后,免疫荧光结果显示,加入100μMH₂O₂的胰岛细胞内的8-羟基脱氧鸟苷显著高于对照胰岛细胞。9.高脂喂养NR4A1 KO小鼠和野生型小鼠8个月后,取出胰岛,TUNEL结果显示,NR4A1 KO小鼠胰岛细胞的凋亡率显著高于野生型小鼠胰岛细胞;免疫荧光结果显示,NR4A1 KO小鼠胰岛细胞内的8-羟基脱氧鸟苷显著高于野生型小鼠。10.核质分离试剂盒分离细胞样品后,Western blot结果显示,NR4A1主要聚集在细胞核内,加入100μMH₂O₂处理后,NR4A1仍然主要聚集在细胞核内。研究结论:通过本部分实验我们得出以下结论:1.在MIN6细胞中,加入活性氧H₂O₂后,能够诱导NR4A1的mRNA水平和蛋白水平表达升高。2.过表达NR4A1能够抑制H₂O₂引起的胰岛β细胞凋亡;敲除NR4A1的小鼠胰岛细胞内更容易积累氧自由基,更容易引起凋亡。3.加入H₂O₂后,NR4A1是在细胞核内发挥抗凋亡作用,而非细胞质。第二部分NR4A1抵抗活性氧所致胰岛β细胞凋亡的分子机制研究研究目的:研究NR4A1通过调节细胞内哪些分子来抵抗H₂O₂引起的胰岛β细胞凋亡。研究内容:1.培养过表达NR4A1的稳定MIN6细胞（OV细胞）和对照细胞（NC细胞）,收集细胞,分别提取RNA和蛋白,利用Q-PCR检测抗氧化分子、抗凋亡分子GPX1、CAT、SOD1、SOD2、WT1、ERG1在mRNA水平的表达量变化,用Western blot检测抗氧化、抗凋亡分子SOD1、SOD2、WT1、Bcl-2、SIRT1在蛋白水平的表达量变化。2.用AdEasy系统构建高表达NR4A1-HA的重组腺病毒。分别用高表达NR4A1的腺病毒感及对照病毒感染培养的MIN6细胞48小时,收集细胞,分别提取RNA和蛋白,利用Q-PCR检测NR4A1、WT1表达量的变化,用Western blot检测抗氧化、凋亡分子SOD1、SOD2、WT1、Bcl-2在蛋白水平的表达量变化。3.用100μM H₂O₂处理过表达NR4A1的稳转MIN6细胞（OV细胞）及对照细胞（NC细胞）,分别在不同时间点（0h、1h、3h、7h、9h、12h）收集细胞,提取蛋白,Western blot检测p-JNK表达量的变化。4.用100lμMH₂O₂处理OV及NC细胞,分别在不同时间点（0h、1h、3h、7h、9h、12 h）收集细胞,提取蛋白,用Western blot检测SOD1、SOD2表达量的变化。5.用l00μMH₂O₂处理OV及NC细胞,分别在不同时间点（0h、1h、3h、7h、9h、12h）收集细胞,提取蛋白,Western blot检测PPARγ表达量的变化。6.用100μM H₂O₂处理OV细胞,分别在不同时间点（0h、3h、6h）收集细胞,用核质分离试剂盒分离细胞的组分,用Western blot检测NF-κB在细胞内的定位。7.通过 NCBI 查找,发现 SOD1、SOD2、GPX1、CAT、WT1、SP1、ERG1、MKP2、MKP7启动子上存在NR4A1的结合位点,将上述基因的启动子连接到pGL-3上,构建荧光素酶报告基因,培养OV、NC细胞,并分别共转染报告基因和TK质粒（内参）,转染24小时后收取细胞,检测生物发光的量。8.将WT1启动子从5’端截短为不同长度（-1522bp、-1022bp、-522bp）,并构建荧光素酶报告基因,培养OV、NC细胞,并分别共转染报告基因和TK质粒（内参）,转染24小时后收取细胞,检测生物发光的量。9.用Ad-NR4A1-HA及Ad-GFP分别感染MIN6细胞48小时,按照ChIP试剂盒操作步骤进行实验,用HA抗体沉淀NR4A1,此时跟NR4A1结合的片段也被一起沉淀,设计引物,用PCR扩增WT1启动子中包含NR4A1结合位点的片段。研究结果:1.在过表达NR4A1的细胞（OV细胞）中抗氧化分子GPX1、CAT、SOD1、WT1、ERG1在mRNA水平显著高于对照细胞（NC细胞）,SOD2mRNA水平无明显变化;SOD1、WT1、Bcl-2的蛋白水平在OV细胞中显著高于对照细胞,SOD2、SIRT1蛋白水平无明显变化。通过查看WT1的启动子的序列,发现:WT1启动子上有一个NR4A1的结合位点（-1118bpto-1111bp）。2.成功构建表达C-端带有HA标签（tag）的NR4A1腺病毒（Ad-NR4A1-HA）,感染MIN6细胞能够达到近100%的感染率。用上述腺病毒及对照病腺毒感染培养的MIN6细胞48小时后,Q-PCR结果显示感染Ad-NR4A1-HA的细胞NR4A1、WT1的mRNA表达量显著高于对照病毒感染的细胞;Western blot结果显示,感染Ad-NR4A1-HA的细胞中SOD1、Bcl-2、WT1的蛋白水平显著高于对照病毒感染的细胞,SOD2蛋白水平无明显变化。3. 100μM H₂O₂处理OV细胞和NC细胞后,Western blot结果显示,JNK的磷酸化水平在OV细胞中显著低于NC细胞,说明JNK的激活在OV细胞中受到抑制。4.100μM H₂O₂处理OV细胞和NC细胞后,Western blot结果显示,在各个时间点OV细胞SOD1的蛋白表达量都远高于NC细胞,而SOD2的蛋白表达量在OV和NC细胞间无明显变化。5.100μM H₂O₂处理OV细胞和NC细胞后,Westeen blot结果显示,PPARγ的蛋白表达量在OV和NC细胞间无明显变化。6.核质分离试剂盒分离细胞组分后,Western blot结果显示,NF-κB主要聚集在细胞质内,加入J00μMH₂O₂处理后,NF-κB仍然主要聚集在细胞质内;而NR4A1分子主要集中在细胞核内。7.双荧光素酶检测实验结果显示,NR4A1能够上调WT1启动子的转录活性,而对其它几个启动子的转录活性无明显改变。8.双荧光素酶检测实验结果显示,NR4A1能够上调-1522bp长度的WT1启动子的转录活性,而对-1022bp、-522bp长度的启动子无明显作用。WT1启动子上NR4A1的结合位点在-1118bp到-1111bp,-1522bp长度的WT1启动子及全长包含此位点,所以NR4A1能够上调它们启动子的转录活性,-1022bp、-522bp长度的启动子不包含此位点,所以NR4A1对它们启动子的转录活性无明显作用。9.用Ad-NR4A1-HA感染的MIN6细胞后,用HA的单克隆抗体对结合NR4A1的染色质片段进行免疫共沉淀（ChIP）,所得到的产物用特异引物扩增含有NR4A1结合位点的片段,结果发现用腺病毒（Ad-NR4A1-HA）感染的细胞样品能扩增出特异性片段,而用对照腺病毒（Ad-GFP）感染的细胞样品不能扩增出此DNA片段。研究结论:通过本部分实验我们得出以下结论:1. NR4A1抵抗H₂O₂引起的MIN6细胞凋亡中,与抗氧化蛋白PPARγ、SIRT]、NF-kB无关。2.NR4A1上调WT1、SOD1的表达量以抑制H₂O₂引起的MIN6细胞凋亡。3. NR4A1能够抑制H₂O₂引起JNK磷酸化而抵抗细胞凋亡。4.NR4A1和WT1基因的启动子有物理结合并促进其转录活性。通过文献检索查找发现WT1能够直接上调SOD1、Bcl-2的表达量;而pJNK能抑制SOD1的表达。综述所述,NR4A1通过两条途径上调SOD1: 1)通过直接上调WT]的表达;2)通过抑制JNK的磷酸化。第三部分NR4A1下游分子WT1和SURVIVIN在抵抗活性氧所致胰岛β凋亡中的作用研究目的:进一步确定WT1对SOD1、Bcl-2的调控以及SURVIVIN能否抵抗H₂O₂引起的MIN6细胞凋亡。研究内容:1.构建靶向WT1的小干扰RNA的慢病毒,通过感染MIN6细胞,药物（嘌呤霉素）筛选得到WT1蛋白表达敲低的细胞株（WT1-KD）,同时,用对照慢病毒得到对照细胞株（CON）。Western blot检测KD和CON细胞内WT1、Bcl-2、SOD1蛋白表达量;用不同浓度的H₂O₂ （0μM、100μM、200μM、400μM）处理两组细胞4小时,用MTT方法检测两组细胞的存活率。2.用100μM H₂O₂处理敲低WT-KD对照细胞,分别在不同时间点（0h、3h、6h、9h、12h）收集样品,用Western blot检测不同时间点Caspase 3活性形式蛋白水平的变化。3.用上述类似的方法得到SURVIVIN敲低的细胞（SURVIVIN-KD）及对照细胞（CON）,用Western blot检测两株细胞内SURVIVIN蛋白表达量;用不同浓度的H₂O₂ （0μM、100μM、200μM、400μM）处理两组细胞4小时,用MTT方法检测两组细胞的存活率。4.用100μM H₂O₂处理SURVIVIN-KD及CON细胞,分别在不同时间点（0h、3h、6h、9h、12h）收取样品,用Western blot检测不同时间点Caspase 3的活性形式的蛋白水平的变化。研究结果:1.成功构建敲低WT1的MIN6细胞株（WT1-KD细胞）及对照细胞（CON细胞）。Western blot结果显示在WT1-KD细胞中WT1、Bcl-2、SOD1表达量显著低于对照细胞;MTT结果显示,WT1-KD细胞的凋亡率显著高于对照组细胞的凋亡率。2.用 100μM H₂O₂ 处理 WT1-KD 细胞和 CON 细胞后,Western blot 结果显示,Caspase 3（活性形式）蛋白水平随着时间的延长而升高,但是各个时间点WT1-KD细胞中的表达量明显高于CON细胞的表达量。3.成功构建敲低SURVIVIN蛋白表达的MIN6细胞株（SURVIVIN-KD）及对照细胞（CON细胞）。Western blot结果显示在SURVIVIN-KD细胞中SURVIVIN表达量显著低于对照细胞;MTT结果显示,SURVIVIN-KD细胞的凋亡率显著高于CON细胞的凋亡率。4.用10μM H₂O₂处理SURVIVIN-KD细胞和CON细胞后,Western blot结果显示,Caspase3 （活性形式）蛋白水平随着时间的延长而升高,但是各个时间点SURVIVIN-KD细胞中的表达量明显高于CON细胞的表达量。研究结论:通过本部分实验我们得出以下结论:1. WT1通过调控Bcl-2、SOD1抵抗H₂O₂引起的MIN6细胞凋亡。2. SURVIVIN同样抵抗H₂O₂引起的MIN6细胞凋亡。