目的:分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞中的分布与定位,探讨两蛋白高表达对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用奠定实验基础。方法:(1)采用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6或pEGFP-C1/hDaxx,Western blot检测DsRed-HPV16 E6和EGFP-hDaxx融合蛋白在HeLa细胞中的表达。(2)瞬时转染或共转染pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6与pEGFP-C1/hDaxx,激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞中的分布,并分析共定位。(3) HPV16 E6与hDaxx真核细胞表达质粒瞬时共转染HeLa细胞,MTT法测定细胞增殖活性。(4)用Hoechst 33258染色细胞核,在荧光显微镜下观察细胞核形态,并对活细胞和凋亡细胞分别计数,计算凋亡率。分别将0μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx和2.0μg pcDNA3.1(-)/HPV16 E6瞬时共转染HeLa细胞,以空细胞组、pcDNA3.1(-)转染组和pcDNA3.1(-)/hDaxx转染组作为对照,TNF-α处理12h后分别收集各组细胞,经70%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞术检测凋亡。(5)按(4)法转染HeLa细胞,TNF-α处理细胞12h后,检测caspase-8与caspase-3的相对活性。结果:(1) Western-blot结果显示HPV16 E6和hDaxx重组质粒转染组均出现了免疫反应带,而空质粒转染组和HeLa细胞组未见免疫反应带。(2)在激光共聚焦显微镜下,DsRed-HPV16 E6融合蛋白所发的红色荧光主要分布于胞核,EGFP-hDaxx融合蛋白所发的绿色荧光仅分布于胞核;HPV16 E6和hDaxx共转染组,绿色荧光和红色荧光在胞浆较弱呈均匀分布,在胞核较强且集中分布在核膜附近,红色荧光同绿色荧光融合成黄色荧光。(3)与HPV16 E6转染组比较,HPV16 E6与hDaxx共转染时,细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(4) TNF-α处理的各组细胞均可见胞核呈现深染、致密的颗粒块状荧光的凋亡细胞。pcDNA3.1(-)/E6转染组凋亡率低于pcDNA3.1(-)转染组,差异有统计学意义(P<0.05);与E6转染组相比,共转染组凋亡率显著升高( P<0.01 ),且凋亡率随pcDNA3.1(-)/hDaxx转染量的增加而升高。(5)与空载体组相比,E6转染组caspase-8和caspase-3两种酶活性均显著降低(P<0.01);与E6转染组相比,共转染组caspase-8和caspase-3相对活性随pcDNA3.1(-)/hDaxx转染量增加而升高;当hDaxx为2.0μg时,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:(1) DsRed-HPV16 E6与EGFP-hDaxx融合蛋白能在HeLa细胞内表达,HPV16 E6使部分hDaxx从细胞核转位至细胞浆,且两者发生共定位。(2) HPV16 E6蛋白抑制TNF-α诱导HeLa细胞凋亡;在表达HPV16 E6蛋白的HeLa细胞,hDaxx高表达通过剂量依赖方式促进TNF-α诱导凋亡。(3) HPV16 E6蛋白可抑制caspase-8与caspase-3的活性,hDaxx高表达下调该抑制作用。