孕马粪便中大豆异黄酮降解菌的筛选及其对大鼠肠道内细菌多样性的影响

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本文旨在从孕马新鲜粪便中分离出对大豆苷元(DAI,Daidzein)具有降解能力的特定细菌菌株,采用单因素和响应面分析法对菌株发酵培养基的主要营养成分进行优化,以及研究分离菌株对大鼠肠道细菌菌群多样性和大豆异黄酮(Soy isoflavones,SIF)代谢的影响。孕马新鲜粪便中大豆异黄酮降解菌的筛选与鉴定。采用亨盖特厌氧滚管法进行培养,通过滚管挑取单菌落与底物DAI进行混合厌氧培养,利用HPLC检测底物DAI被转化的情况。选择可降解DAI的菌株,进行16S r DNA序列分析,构建菌株系统进化树,并结合菌株的形态特征以及生理生化反应,对该菌株进行鉴定。试验从孕马新鲜粪便中筛选出一株降解DAI产生二氢大豆苷元(Dihydrodaidzein,DHD)的兼性厌氧菌株,命名为HXBM408(MF992210),16S r DNA序列测序结果进行BLAST比对,发现该菌株与Pediococcus acidilactici strain DSM(NR042057)相似度为99%,结合菌株的形态特征以及生理生化反应结果,鉴定该菌株为Pediococcus acidilactici。响应面法优化产二氢大豆苷元菌株发酵培养基。以BHI培养基为基础,通过单因素试验确定主要因素(碳源、氮源、生长因子和无机盐)及其适宜的浓度范围,利用Box-Behnken中心组合试验设计,采用响应面法进行回归分析,确定培养基中的最佳组成成分。通过单因素试验确定了葡萄糖、蛋白胨、VB1和KH2PO4能够提高DHD的含量,响应面分析法进一步确定在以BHI培养基为基础的条件下,葡萄糖的补充量为10.22 g/L、蛋白胨为6.00 g/L、VB1为0.49 g/L、KH2PO4为0.82 g/L。验证试验显示在培养基优化后的条件下,DHD的产生量为0.27μg/m L,与预测值0.28μg/m L接近。大豆异黄酮转化菌对大鼠肠道细菌菌群多样性及其对大豆异黄酮代谢的影响。选择平均体重为(160.00±10.00)g的雌性SD大鼠20只,随机分为2组,分别为试验组和对照组。两组大鼠首先使用抗生素(阿奇霉素)连续灌胃7 d,之后试验组大鼠连续灌胃HXBM408菌液和DAI 7 d,对照组大鼠连续灌胃灭菌水和DAI 7 d;采集大鼠粪便、肠道内容物和血浆,使用HPLC测定大鼠粪便和血浆中DAI和其代谢物含量,应用Ion S5TMXL技术测定粪便和肠道内容物的细菌多样性。试验第7天和第14天,大鼠粪便中Eq的含量试验组显著高于对照组(P<0.05),随着时间延长,DAI及其代谢物含量差异不显著(P>0.05);大鼠血浆中DAI及其代谢物含量差异不显著(P>0.05);试验第7天试验组大鼠粪便细菌相对丰度估量值显著低于对照组(P<0.05),随着时间延长差异不显著(P>0.05)。大鼠肠道内容物中变形菌门试验组显著低于对照组(P<0.05);试验第7天大鼠粪便中毛螺菌科、链球菌科、链球菌属试验组显著高于对照组(P<0.05),随着时间延长差异不显著(P>0.05)。大鼠肠道内容物中拟杆菌科、拟杆菌属试验组极显著高于对照组(P<0.01),链球菌科、链球菌属试验组显著低于对照组(P<0.05)。从孕马新鲜粪便中筛选出一株菌株HXBM408可降解DAI产生DHD。菌株发酵培养基最佳成分为38 g/L的BHI、10.22 g/L的葡萄糖、6.00 g/L的蛋白胨、0.49 g/L的VB1、0.82 g/L的KH2PO4。口服灌胃大鼠后可短期提高SIF的降解能力,并能调节肠道内的菌群结构。
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