研究背景镉(cadmium,Cd)是一种常见的环境毒物和工业污染物,可通过被污染的食物、饮用水、吸烟和职业接触等途径进入人体。镉的生物半衰期较长并可以蓄积于不同靶器官,镉暴露会严重危害人体健康,它可以对骨骼、肾脏、肝脏、生殖和免疫等器官产生毒性作用,其中肾脏是镉产生危害的重要靶器官。镉可以诱导肝脏产生金属硫蛋白(Metallothionein,MT)并结合成Cd-MT,Cd-MT随血液循环转移至肾脏和其他靶器官。镉可通过应激反应损伤肾小球、近曲小管和远曲小管,在血液循环中以自由离子或和血浆蛋白结合以结合金属硫蛋白的形式存在,经肾小球滤过,可以直接损伤肾小球导致蛋白尿,镉蓄积还可以造成肾小管重吸收功能障碍。肾小球细胞主要由肾小球内皮细胞、肾系膜细胞和肾足细胞组成,我们的前期研究发现:低浓度镉对肾小球内皮细胞功能无显著影响,然而低浓度镉对肾系膜细胞和肾足细胞功能的影响尚不明确,需要进一步研究。c-Jun氨基末端激酶(JNK)家族是促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)成员之一,可被细胞因子、生长因子、应激等多种因素激活,参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架构建等多种生物学反应。JNK被上游信号激活后,磷酸化核内的转录因子c-Jun氨基末端63及73位的丝氨酸残基,进而激活c-Jun而增强其转录活性。c-Jun氨基末端的磷酸化还可以促进c-Jun/c-Fos异二聚体及c-Jun同二聚体的形成,c-Jun和c-Fos是AP-1的重要组成成分。这些转录因子可以结合到许多基因启动子区活化AP-1位点,增加特定基因的转录活性。有研究表明多种应激信号可以激活JNK信号通路进而影响应激相关基因的转录和表达,镉是否通过激活JNK信号通路影响肾系膜细胞和肾足细胞的功能尚不明确。因此,我们建立镉处理的细胞模型,采用镉刺激体外培养的肾系膜细胞和肾足细胞,观察低浓度镉对肾系膜细胞和肾足细胞功能的影响,并探讨JNK信号通路在低浓度镉对肾系膜细胞和肾足细胞功能影响中的作用,为镉肾毒性相关疾病的治疗提供全新思路。研究目的1.探讨低浓度镉对肾系膜细胞功能的作用及JNK通路在镉诱导的功能改变中的作用。2.探讨低浓度镉对肾足细胞功能的作用及JNK通路在镉诱导的功能改变中的作用。研究方法1.低浓度镉对肾系膜细胞功能的作用及机制研究1.1低浓度镉对肾系膜细胞增殖和活性影响将肾系膜细胞加镉处理24 h,本研究通过MTT实验、细胞计数和测定增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达量来检测细胞增殖,采用台盼蓝染色实验检测细胞活力。1.2低浓度镉对肾系膜细胞表面标志物影响将肾系膜细胞加镉处理24 h,通过免疫荧光实验检测肾系膜细胞表面标志物α-SMA 和 PDGFR-β 的表达。1.3低浓度镉对肾系膜细胞细胞骨架F-act i n影响通过Phalloidin染色实验检测镉、JNK抑制剂SP600125和镉加JNK抑制剂SP600125对肾系膜细胞细胞骨架F-actin影响。1.4低浓度镉对肾系膜细胞JNK信号通路影响将体外培养的肾系膜细胞加镉处理Oh、1h、2h、6h、12h、24h,提取细胞总蛋白,通过Western blotting实验观察4 μM镉对肾系膜细胞Total JNK、p-JNK、c-Jun、c-Fos 表达的影响。1.5 JNK抑制剂对镉刺激的肾系膜细胞增殖的影响将肾系膜细胞加JNK信号通路抑制剂SP600125预处理1 h,再加镉处理24 h,通过MTT实验检测肾系膜细胞增殖能力变化,通过Western blotting实验检测肾系膜细胞PCNA的表达情况。2.低浓度镉对肾足细胞功能的作用及机制研究2.1低浓度镉对肾足细胞细胞骨架F-actin影响通过Phalloidin染色实验检测镉、JNK抑制剂SP600125和镉加JNK抑制剂SP600125对肾足细胞细胞骨架F-actin影响。2.2低浓度镉对肾足细胞增殖、活力和表面标志物影响将肾足细胞加镉处理24 h,通过MTT实验检测肾足细胞增殖变化,通过台盼蓝染色实验检测镉对肾足细胞活力影响,通过免疫荧光实验检测镉对肾足细胞表面标志物CD2AP和Synaptopodin表达的影响。2.3低浓度镉对肾足细胞JNK信号通路影响体外培养的肾足细胞,采用镉处理0h、1h、2 h、6 h、12 h、24 h,提取细胞总蛋白,通过Western blotting实验观察4μM镉对肾足细胞Total JNK、p-JNK、c-Jun、c-Fos表达的影响。2.4 JNK抑制剂对镉刺激的肾足细胞增殖和活力的影响将肾足细胞加JNK信号通路抑制剂SP600125预处理1 h,再加镉处理24 h,通过MTT实验、台盼蓝染色实验检测JNK抑制剂对镉刺激的肾足细胞增殖和活力的影响。研究结果1.低浓度镉对肾系膜细胞功能的作用及机制研究1.1低浓度镉抑制肾系膜细胞增殖为了研究镉对肾系膜细胞增殖的影响,本研究通过MTT实验、细胞计数和测定增殖细胞核抗原(PCNA)的表达量来检测细胞增殖。研究发现:镉处理24h后,MTT实验OD值和细胞计数均降低(p<0.01);PCNA是细胞增殖的标志,镉处理细胞24 h后,免疫印迹分析发现:PCNA的表达量降低(1vs.0.59±0.02,p<0.01);此外,研究发现:镉没有显著影响细胞活力(p = 0.219),以上结果提示:镉降低肾系膜细胞增殖而对细胞活力无显著影响。1.2低浓度镉对肾系膜细胞表面标志物α-SMA和PDGFR-β表达无显著影响采用免疫荧光实验检测肾系膜细胞表面标记物α-SMA和PDGFR-β的表达情况,研究发现:镉处理肾系膜细胞24 h后,不显著改变α-SMA和PDGFR-β的表达。上述结果提示:低浓度镉没有诱导肾系膜细胞转分化。1.3低浓度镉对肾系膜细胞细胞骨架F-act i n表达和分布无显著影响本研究中我们用荧光标记的鬼笔环肽检测肾系膜细胞细胞骨架F-actin的表达和分布情况。研究发现:镉不显著改变F-actin的表达和分布,镉刺激组和对照组无显著性差异;此外,镉加SP600125共同刺激组和SP600125组F-actin表达也无明显变化。1.4低浓度镉活化肾系膜细胞JNK信号通路检测低浓度(4 μM)镉暴露是否活化肾系膜细胞JNK信号通路,我们应用Western blotting实验检测总JNK、p-JNK、c-Jun和c-Fos的表达量。结果显示:p-JNK的表达量明显增高,总JNK的表达量无明显变化;我们还发现:JNK信号通路的下游转录因子c-Jun、c-Fos的表达量也明显增加。上述结果提示:低浓度镉活化肾系膜细胞JNK信号通路,增加p-JNK、c-Jun和c-Fos的表达。1.5低浓度镉依赖于JNK信号通路活化抑制肾系膜细胞增殖采用10μM JNK信号通路选择性抑制剂SP600125预处理细胞1 h,抑制镉所诱导的JNK信号通路活化,再加镉处理细胞24h,MTT实验OD值、细胞计数、PCNA的表达量等结果证实细胞增殖能力无显著变化(p = 0.655,p = 0.657,p = 0.938)。提示JNK信号通路介导镉诱导的肾系膜细胞增殖降低。2.低浓度镉对肾足细胞功能的作用及机制研究2.1低浓度镉不显著改变肾足细胞细胞骨架F-act in的表达和分布应用荧光标记的鬼笔环肽检测细胞骨架F-actin的表达和分布,结果发现镉不显著改变肾足细胞F-actin的表达和分布。2.2低浓度镉不显著改变肾足细胞增殖、活力和表面标志物表达镉处理细胞24 h,通过MTT实验发现镉不显著改变肾足细胞增殖,台盼蓝染色实验发现:镉对肾足细胞活力无显著影响。应用免疫荧光实验检测肾足细胞表面标记物的表达,结果表明:镉处理24h对CD2AP和Synaptopodin的表达无显著影响。以上结果表明:低浓度镉不显著改变肾足细胞增殖、活力,低浓度镉刺激肾足细胞没有使细胞表型发生转化。2.3低浓度镉活化肾足细胞JNK信号通路采用Western blotting实验检测发现镉活化肾足细胞JNK信号通路,增加p-JNK的表达,而总的JNK没有明显变化;另外,镉显著增加肾足细胞c-Jun和c-Fos的蛋白表达量。上述结果提示:低浓度镉活化肾足细胞JNK信号通路,增加 p-JNK、c-Jun 和 c-Fos 的表达。2.4 JNK抑制剂对镉刺激的肾足细胞功能无显著影响我们研究发现镉和JNK抑制剂SP600125共处理组和单独SP600125处理组相比,肾足细胞F-actin的表达和分布无明显差异,细胞增殖和活力无显著差异。研究结论1.低浓度镉显著降低肾系膜细胞的增殖能力,但对系膜细胞活性、细胞表面标志物α-SMA和PDGFR-β的表达及细胞骨架F-actin的表达和分布无显著影响;镉激活肾系膜细胞JNK信号通路,并且JNK信号通路介导系膜细胞增殖的降低。2.低浓度镉不显著改变肾足细胞细胞表面标志物CD2AP和Synaptopodin的表达及细胞骨架F-actin的表达和分布;镉显著活化肾足细胞JNK信号通路,但对其细胞活性、增殖无显著影响。