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口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)是家畜口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)的病原,主要侵染牛、羊、猪等偶蹄动物,引起传染性极强的群发疫病。该病的特征症状是口、鼻、蹄和乳房等部位出现水疱,可见FMDV主要侵染宿主的上皮组织。近几年发现的IFN-λ3是III型干扰素(interferon,IFN)的成员之一,主要产生靶向上皮组织的专一抗病毒效果。目前,对FMDV与猪源IFN-λ3的关系了解甚少,因此,猪源IFN-λ3的研究将为更加有效防控FMD提供新的思路。FMDV前导(leader)蛋白(Lpro)是拮抗宿主细胞天然免疫应答的重要蛋白。Lpro能通过多种途径调控IFN的表达,推测也能调控IFN-λ3的产生。为了获得抗Lpro抗体,本研究采用原核表达获得了重组Lpro,利用其制备了高效价的兔抗血清,该血清能够特异性识别FMDV感染过程中产生的Lpro。为了获得猪源IFN-λ3蛋白,将猪源IFN-λ3基因定向克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,利用大肠杆菌BL21表达了目的蛋白,最终获得了重组猪源IFN-λ3蛋白。用纯化的猪源IFN-λ3蛋白研究其对FMDV复制的影响,发现IFN-λ3以剂量依赖性方式抑制FMDV增殖,用siRNA技术将细胞内IFN-λ3进行基因沉默后,发现FMDV的复制水平升高,这些结果说明猪源IFN-λ3具有抗FMDV复制的作用。本研究也检测了FMDV感染对IFN-λ3表达的影响,结果显示病毒感染减少了poly(I:C)诱导的IFN-λ3生成,表明FMDV能够利用某种机制拮抗IFN-λ3的抗病毒效应。本研究发现FMDV编码的Lpro发挥抑制IFN-λ3表达的作用,且该抑制作用与Lpro的切割功能相关。Jaspar软件预测结果显示猪源IFN-λ3启动子序列上有NF-κB(nuclear factor kappa-B)结合位点。p65/RelA是NF-κB的活性亚基,有调控IFN转录的作用,据此推测p65/RelA很可能参与IFN-λ3的激活。实验结果发现,过表达p65/RelA显著升高IFN-λ3的mRNA的水平,还能抑制FMDV的复制,说明p65/RelA确实参与调控IFN-λ3表达。接下来探究Lpro能否通过作用p65/RelA而调控IFN-λ3的产生,Western blotting试验证明Lpro不仅能降解内源p65/RelA,还能切割外源p65/RelA,而且切割位点突变后不能检测到p65/RelA切割条带。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay,IFA)结果显示Lpro与p65/RelA在细胞核共定位。以上这些发现表明Lpro能够直接切割p65/RelA,Lpro与p65/RelA的相互作用导致Lpro下调p65/RelA介导的IFN-λ3表达,该下调能力也与Lpro的切割功能有关。综上所述,本研究制备了Lpro兔抗血清和猪源IFN-λ3蛋白,发现FMDV利用自身编码的Lpro切割p65/RelA从而拮抗IFN-λ3抗病毒反应,深化了对FMDV致病机制的认识,为发展新型FMD防控技术提供了理论支持。